به خاطر انتشار ژنهای مقاومت به آنتیبیوتیک در طبیعت یا فرار ژنهای مقاومت به علفکش به گونههای علفی وحشی، دانشمندان به دنبال راهحلهایی برای تولید “گیاهان تراریخته عاری از نشانگر”[۱] هستند.
این گیاهان در ابتدا بر مبنای مقاومت به آنتیبیوتیک و علفکش انتخاب شده ولی در مراحل بعدی دستورزی و رشد گیاهان، نشانگر انتخابی برداشته خواهد شد. روشهای مختلفی برای حذف نشانگر انتخابی از گیاهان تراریخته اولیه پیشنهاد شده است. این روشها شامل استفاده از سیستم نوترکیبی در جایگاه اختصاصی، مثل Cre-lox یا Flp-Frt برای برداشتن نشانگر، “حرکت ترانسپوزونی”[۲] نشانگر انتخابی از جایگاه اولیه خود پس از ورود به ژنوم گیاهی، به طور کامل یا به جایگاهی غیر مرتبط که در نسلهای بعدی تفرق یابد، یا بهرهبرداری از چندین T-DNA که در جایگاههای غیر مرتبط وارد شده و در مراحل بعدی تفرق یابند، میشود.
هر کدام از این سیستمها مزایا و معایب خود را دارند. به طور مثال، خروج ژن نشانگر با استفاده سیستم نوترکیبی جایگاه اختصاصی، به ورود آنزیم site-specific recombinase به داخل گیاه به وسیله انتقال ژن یا تلاقی ژنتیکی نیاز دارد. تفرق نشانگرها نیز فقط در نسلهای گیاهان تراریخته رخ داده و محدود به گونههایی است که به طور طبیعی از طریق بذر تکثیر میشوند و شامل گیاهان با تکثیر رویشی نمیشود.
تحقیقات اولیه درباره الگوی تفرق T-DNA در تومورهای گال تاجی حاکی از آن است که دو T-DNA رمزشده توسط یک پلاسمید Ti نوع octopine میتوانند به طور مستقل و در برخی اوقات در چند نسخه، وارد ژنوم گیاه شوند. آنالیز مولکولی نشان میدهد که این T-DNAها میتوانستند در جایگاههای غیر مرتبط وارد شوند. این نتایج نشاندهنده این موضوع است که انتقال ژن توام برای ادغام تراژنهایی که توسط دو T-DNA مختلف حمل میشوند، امکانپذیر بوده و شاید این T-DNAها در نسلهای بعدی از همدیگر تفرق یابند. در نتیجه سه رهیافت برای انتقال ژن توام استفاده میشود:
۱) ورود دو T-DNA، هر کدام از یک باکتری مختلف؛
۲) ورود دو T-DNA که توسط رپلیکونهای جداگانه در یک باکتری حمل میشوند؛
۳) ورود دو T-DNA که در بر روی یک رپلیکون و در یک باکتری قرار گرفتهاند.
آزمایشهای اولیه با استفاده از این سه رهیافت نشان میدهد که انتقال ژن توام تکرارپذیر است. An و همکارانش نشان دادند که میتوان انتقال ژن توام به سلولهای توتون و ایجاد دو فنوتیپ مختلف را با استفاده از یک سویه آگروباکتریوم که دارای یک پلاسمید Ti بوده (رشد مستقل از فیتوهورمون) یا یک T-DNA ناقل دوتایی T-DNA (رشد مقاوم به کانامایسین)، انجام داد. این آزمایش نمایانگر رهیافت “یک سویه، دو رپلیکون” انتقال ژن است.
وقتی سلولها برای مقاومت به آنتیبیوتیک مورد انتخاب قرار گرفتند، ۱۰ تا ۲۰ درصد آنها رشد مستقل از هورمونهای گیاهی نیز نشان دادند، در حالیکه اگر انتخاب اول برای رشد مستقل از هورمونهای گیاهی انجام میگرفت، ۶۰ درصد کلوسهای ایجاد شده، به کانامایسیم مقاوم بودند. این محققان، معتقد بودند که دلیل این تفاوت فراوانی، تعداد نسخه بیشتر (۵ تا ۱۰) ناقل دوتایی در باکتری، نسبت به تک نسخه پلاسمید Ti میباشد.
این آزمایشها توسط Frammond و همکارانش ادامه یافت و آنها توانستند از بافتهای همسانهسازیشده توتون که به وسیله T-DNA از یک پلاسمید Ti و یک میکرو Ti[۳] (رهیافت یک سویه، دو رپلیکون) انتقال ژن به آنها صورت گرفته بود، گیاهان تراریخته بارور باززایی کنند. تفرق دو T-DNA در نتاج حاصل،
نشان داد که T-DNAها در دو مکان ژنی جداگانه ادغام شده بودند. گروههای دیگری رهیافت یک سویه، دو رپلیکون را برای تولید گیاهان تراریختهاستفاده کردند که در ابتدا هر دو نشانگر T-DNAها ابراز شده ولی در ادامه این دو نشانگر از یکدیگر تفرق یافتند.
Depicker و همکارانش آزمایش مشابهی انجام دادند که نشانگرهای انتخابی آن، رشد مستقل از هورمونهای گیاهی و ساخت nopaline (رمزشده توسط یک پلاسمید Ti) و رشد مقاوم به کانامایسین (رمزشده توسط یک ناقل دوتایی) بود. آنها آزمایش را از دو راه انجام دادند:
۱) یا دو T-DNA با دو سویه مختلف آگروباکتریوم منتقل شدند (رهیافت دو سویه، دو رپلیکون)،
۲) یا هر دو T-DNA با یک رپلیکون در یک سویه منقل شدند (رهیافت یک سویه، یک رپلیکون). نتیجه آزمایشها این بود که انتقال توام T-DNAها توسط یک پلاسمید در یک سویه به طور قابل ملاحظهای کاراتر از انتقال توسط دو سویه متفاوت میباشد.
استفاده از یک سویه آگروباکتریوم و انتقال توام دو T-DNA از یک رپلیکون مشابه و پیگیری تفرق ژن انتخابی تا تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر، توسط Komari و همکارانش و Xing و همکارانش نیز مورد بررسی قرار گرفته است. در هر کدام از این مطالعات، محققان موفق به تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر با فراوانی بالایی شدهاند.
استفاده از دو سویه مختلف آگروباکتریوم برای ارسال T-DNAهای مختلف به یک سلول گیاهی، توسط گروههای متعددی انجام شده است. گرچه انتقال توام T-DNAها به جایگاههای غیر مرتبط ژنتیکی گزارش شده است، اما برخی محققان نشان دادهاند که در بسیاری از موارد، پیوستگی[۴] زیادی بین T-DNAهای مختلف وجود دارد. بر این اساس، هنوز کاملاً روشن نیست که کدام یک از این رهیافتهای انتقال ژن توام، برای تولید گیاهان تراریخته عاری از نشانگر مناسبتر هستند.
