اصول PCR

اصول PCR

مقدماتی بر اصول PCR

مقدمه:
امروزه روش های بیولوژی و مولکولی و مهندسی ژنتیک کاربردی وسیعی در علوم زیستی یافته و به دلیل سرعت و دقت جایگزین روش های متداول می شوند. کاربرد وسیع این روش ها در تشخیص عوامل بیماری زا ، تعیین توالی ژن ها ، طبقه بندی ارگانیسم ها و عوامل بیماری زا در اپیدمی های مختلف در مناطق مختلف جهان ، ایجاد تغییرات ژنتیکی در باکتریها ، ویروس ها ، گیاهان ، و حتی جانوران در جهت افزایش کارایی و یا درمان بیماری ها همگی از اهمیت و نیاز به فراگیری و راه اندازی این روش ها در آزمایشگاه های تحقیقاتی علوم زیستی حکایت دارد.
Polymerase Chin Reaction (PCR)(واکنش زنجیری پلیمراز):
واکنش زنجیری پلیمراز روشی است که در آن با یک برنامه ی دوره ای تکرار شونده از گرم و سرد کردن DNA به همراه یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت و دو توالی ویژه DNA به عنوان پرایمر به منظور تکثیر انتخابی یک بخش کوچک اختصاصی از ژنوم استفاده می شود. فرایند تکثیر DNA با این روش به صورت تصاعد هندسی است و بنابراین می توان مقادیر زیاد DNA بدست آورد. به عنوان نمونه وقتی از PCR استفاده می شود که مقادیر بسیار جزئی از توالی ویژه ای در اختیار است. و به منظور مطالعه ی این ژن ها این DNA باید آن را به دفعات زیاد تکثیر کرد. تا به مقدار کافی در دسترس قرار گیرد.
امروزه روش PCR جایگاه بسیار مهمی را در جنبه های مختلف مهندسی ژنتیک ، بیولوژی مولکولی ، میکروب شناسی تشخیصی ، تشخیص سرطان و بیماری های ژنتیک ، تشخیص هویت ، جرم شناسی ، تعیین ترادف ، باستان شناسی ، مطالعه تکاملی موجودات و … پیدا کرده است.
بحث:
برای تولید و تکثیر DNA در آزمایشگاه دو روش اصلی وجود دارد:
1) سنتز شیمیایی
2) Polymerase Chin Reaction (PCR)
این تکنیک در اواسط دهه ی 1980 به وسیله ی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربرد و مزیت های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریبا در تمامی آزمایشگاه های زیست مولکولی جزء کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتیک به وسیله ی کامپیوتر انجام می شود. این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را بر طرف کرد. برای مثال قبلا برای بدست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص می بایست این ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرد و در یک باکتری تکثیر کنند. ولی امروزه این کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند. (1)
PCR از نظر اصول علمی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. روش PCR تحول مهمی را در بیولوژی مولکولی پدید آورده است. با این روش می توان قطعات DNA از سلولهای مختلف ، زنجیر مفرد DNA یا مولکول های RNA حتی DNA از یک سلول تنها را تکثیر نمود. اسیدهای نوکلئیک این منابع به عنوان الگو برای سنتز DNA عمل می کند. این روش به ویژه در میکروبیولوژی تشخیصی ، ویروس شناسی و پزشک قانونی برای مشاهده و تکثیر قطعات مهم تشخیصی از مولکول DNA مفید است.(3)
کاربرد PCR :
بطور کلی به دو منظور اصلی به کار می رود:
1) تهیه نسخه های متعدد از یک ژن
2) بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه ی DNA . (1)
که کاربرد دوم از اهمیت بیشتر برخوردار است. از جمله موارد استفاده کاربرد دوم می توان به تشخیص بیماری های ژنتیکی در قبل از تولد اشاره کرد. و دیگری تعیین جنسیت ، بررسی عفونت های باکتریایی و ویروسی که در قدیم از کشت استفاده می شد که وقت گیر بود و عدم حساسیت لازم را دارند ولی با PCR می توان حتی یک ویروس یا یک باکتری را تشخیص داد.
استفاده از تکنیک های کشت آزمایشگاهی برای شناسایی پاتوژن های میکروبی (ویروسی ، باکتریایی ، انگلی) با دو مشکل روبرو است :
1) میکروارگانیسم هایی که نتوانند در آزمایشگاه رشد کرده تا به راحتی مشاهده شوند ، در آب قابل تشخیص نیستند (زنده اما غیر قابل کشت). باکتری در این حالت زنده است و در صورت خورده شدن می توان ایجاد بیماری کنند اما قادر نیستند در محیط های آزمایشگاهی رشد کنند.
2) زمان لازم برای گرفتن جواب مثبت یا منفی طولانی است و روز ها تا هفته ها به طول می انجامد. اما تکنیک های جدیدی برای تعیین سریع ، حساس و اختصاصی پاتوژن ها در محیط طرح ریزی شده که یکی از آن ها استفاده از پروب های ژنتیکی و یا به کار بردن PCR است.(1)
اصول و روش PCR :
عبارت است از ساخته شدن آنزیمی و تکراری DNA با استفاده از دو پرایمر الیگو نوکلئوتیدی که با رشته های مخالف DNA جفت شده اند و DNA مورد نظر را محدود می کنند. در عمل 25 چرخه موجب افزایشی برابر با حدویک میلیون برابر در تعداد کپی های DNA می شود. پرایمر ها معمولا الیگو نوکلئوتیدهایی اختصاصی با طول 20 تا 30 باز هستند که با دقت برای محدود کردن و تکثیر DNA هدف مورد نظر انتخاب می شوند.(1)
تکثیر DNA و RNA با استفاده از PCR :
این واکنش به وسیله DNA پلیمراز کاتالیز می شود ، ترادف های خاصی از DNA به طور مکرر ساخته می شود. هر چرخه شامل: تک رشته شدن DNA دو رشته ای ، چسبیدن پرایمرهای الیگو نوکلئوتیدی کوتاه به تک رشته ها و طویل شدن ترادف های پرایمر با استفاده از DNA پلیمراز برای ساخته شدن رشته های مکمل می باشد. با تکرار چرخه ها کپی های DNA ساخته شده تصاعدی افزایش می یابد.(1)
استخراج ماده ژنتیکی:
اولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی با خالص سازی DNA و RNA می باشد. که این کار دارای مراحلی است که عبارتند از :
1) شکستن سلول: چون DNA و RNA در داخل سلول قرار دارند جهت جداسازی آن ها ابتدا باید سلول شکسته شود که با توجه به نوع سلول ، روش شکستن متفاوت می باشد. به عنوان مثال سلول های حیوانی را معمولا با استفاده از شک اسمزی یا دترجنت های یونی مثل سدیم دوسیل سولفات شکافته میشود. ولی سلول های گیاهی به دلیل داشتن دیواره سخت پکتینی یا سلولزی نیاز به انزیم های پکتیناز و سلولاز دارند. در مورد باکتری ها با توجه با گرم مثبت یا گرم منفی بودنشان عملیات متفاوتی روی آن ها انجام می گیرد. باکتریهای گرم مثبت دارای دیواره ی پپتیدوگلیکان قوی یا ضخیمی می باشند که جهت شکستن آن نیاز به آنزیم لیزیزوم می باشد و مدت زمان نسبتا زیادی احتیاج دارند. در مورد باکتری های گرم منفی به دلیل وجود لایه بیرونی یا outer membrain در دور غشاء این باکتری ها آنزیم لیزیزوم نمی تواند روی دیواره ی سلولی اثر کند ، در نتیجه نیاز به موادی مانند EDTA می باشد که ابتدا غشاء خارجی را حل کرده و سپس راه را برای عملکر آنزیم لیزیزوم باز می کند. با توجه به حساس بودن ماده ژنتیکی (DNA و RNA) به شکستگی ، این کارها باید با ملایمت و در بافر انجام گیرد. این بافر می تواند شامل بافر Tris Hcl و یا شامل SDS باشد ، که SDS دارای دو اثر مهم می باشد: یکی حل شدن چربی ها را انجام می دهد و دیگری به DNA وصل شده و سبب پایداری آن میشود.
2) رسوب دادن DNA و RNA : با شکسته شدن سلول محتویات آن به داخل محیط ریخته که علاوه بر ماده ژنتیکی ، دارای پروتئین ، چربی و … نیز می باشد. جهت جداسازی ماده ژنتیکی از این محلول ، از الکل استفاده می گردد. که الکل سرد را به این سوسپانسیون اضافه کرده و سپس در فریز قرار می دهند ، الکل سبب تجمع و رسوب ماده ژنتیکی می شود.
3) جدا کردن DNA و RNA : برای این کار از میله شیشه ای نازک استفاده می شود. بدین گونه که میله را به آرامی داخل لوله فرو برده و می چرخانید که رشته DNA و RNA به دور میله چسبیده و سپس میله را به آرامی خارج کنید و در یک لوله دیگر محتوی بافر وارد کرده ، به آرامی تکان دهید تا DNA در آن حل شود. دقت گردد همه ی این مراحل با ملایمت و آرامش انجام شود ، زیرا رشته های DNA حساس بوده و به راحتی می شکنند.
4) رسوب پروتئین ها : DNA و RNA بدست آمده از مراحل قبل ، هرچقدر هم خالص باشند باز هم احتمال وجود میزان کمی پروتئین و نا خالصی به همراه آنان وجود دارد که در این مرحله جهت خالص سازی بیشتر ماده ژنتیکی باید پروتئین ها رسوب داده شوند ، که جهت این کار از فنل و یا محلول های غلیظ نمک های مختلف استفاده می گردد که پروتئین ها دناتوره شده رسوب می کنند.
5) جداسازی DNA و RNA از یکدیگر : در این مرحله با توجه به نیاز می توان از آنزیم RNA آز و یا DNA آز استفاده کرد ، بدین گونه که اگر DNA مورد نیاز باشد از آنزیم RNA آز استفاده کرده کرده تا RNA موجود در محیط لایز کشته و در مرحله ی بعد بتوان آن ها را از هم جدا کرد.
6) رسوب با اتر: در این مرحله با استفاده از اتر ماده ژنتیکی لایز نشده که همان ماده مورد نظر ماست ، رسوب کرده و قابل جداسازی از محیط می باشد.
7) جهت بررسی و تایید درستی مراحل انجام شده پیشین ، با استفاده از اسپکتروفتومتری می توان نتجه گرفت. بدین گونه که DNA و RNA در طول موج 260 نانومتر داراری جذب می باشند. پس با قرار دادن محلول در دستگاه و تعیین جذب آن در طول موج 260 نانومتر میتوان پی به درستی انجام کار و میزان ماده ژنتیکی موجود در محلول برد. (1،2،3،4)
مواد لازم و اصلی برای PCR :
1) دو پرایمر الیگو نوکلئوتیدی سنتزی (هر یک حدود 20 نوکلئوتید) که مناطقی بر روی دو رشته ی مخالف بوده و در کنارتوالی DNA هدف قرار می گیرد. و پس از ترکیب شدن با DNA مورد بررسی ، پایانه های ́ 3-هیدروکسیل آن ها به سمت یکدیگر جهت گیری می نماید.
2) یک توالی هدف در نمونه DNA که بین جفت پرایمر ها قرار می گیرد و می تواند از 100 تا 35 هزار bp طول داشته باشد.
3) یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت که گرمای تا 95 درجه ی سانتی گراد و بالاتر را تحمل نماید.
4) چهار نوع دی اکسی ریبونوکلئوتید
5) بافر PCR: این بافر از ترکیبات مختلفی تشکیل می شود ،که برای آنزیم های مختلف و نیز برای هر آنزیم ، تولید توسط تولید کننده های مختلف متفاوت می باشد.
6) Mgcl2 : مقدار Mgcl2 بستگی به پرایمر و DNA از 1 الی 10 میلی مولار متغییر است.
7) آب : برای تامین محیط واکنش و کامل کردن حجم واکنش از آب مقطر استریل استفاده می شود.
8) ژلاتین یا سرم آلبومین گاوی(5)
جهت شروع کار DNA پلیمراز ، ابتدا نیاز به یک قطعه ی اولیه آغازگر یا پرایمر می باشد. جهت انجام PCR به موادی احتیاج است که شامل آنزیم DNA پلیمراز ، نوکلئوتید ، فسفات ها که dntp می باشد و دقت شود که حتما 4 نوکلئوتید در محیط قرار گیرند. پرایمر ها که الیگو نوکلئوتید هستند که توالی های خاصی را در قبل از ژن مورد نظر تشخیص می دهد و یا شناسایی می کند و به آن متصل می شود.جهت عمل این گونه الیگو نوکلئوتید ها دو مورد ذکر شده:
1- تعیین نقطه شروع همانند سازی: که ابتدا باید پرایمر به محل مورد نظر بچسبد ، بعد DNA پلیمراز کارش را شروع می کند.
2- تعیین اندازه ی ژن مورد نظر: به دلیل وجود دو پرایمر (یکی قبل از ژن و دیگری بعد از ژن)
در PCR ترادف های هدف خاص از اسید نوکلئیک تکثیر می شود.هر دی اکسی ریبو نوکلئیک اسید (DNA) از چهار نوع دای اکسی نوکلئوتید دارای باز های گوانین (G) ، سیتوزین (C) ، آدنین (A) و تیمین (T) ساخته شده است. ترادف های این دی اکسی نوکلئوتید ها ، پروتئین ها خاصی را که محصولات ژن هستند را کد می کنند. بعلاوه ، دو رشته ی DNA با پیوندهای هیدروژنی به یکدیگر متصل شده اند. این پیوندها بسیار اختصاصی می باشند ، به طوری که گوانین فقط با سیتوزین و آدنین فقط با تیمین جفت می شوند و این بازها تکیمل کننده ی یکدیگرند. بنابراین دو رشته ی DNA فقط تشکیل DNA دو رشته ای می دهند که ترادف باز های هریک از آن ها مکمل ترادف بازهای دیگری باشد. به بیان دیگر ، ترادفی از DNA به صورت زیر است:
(A – T – A – G – G – T)
فقط با رشته ی مکمل خود به صورت زیر جفت می شود:
(T – A – T – C – C – A)
و به شکل زیر در می آید:
(A – T – A – G – G – T)
(T – A – T – C – C – A)
و این موضوع مبنای ترکیب DNA است ، زیرا DNA دو رشته ای تولید شده ، ترکیبی از رشته های جداگانه می باشد.
این اطلاعات ، برای انجام PCR از آنزیمی که DNA Taq پلیمراز نامیده می شود ، استفاده می کند که می تواند از رزوی یک رشته ی DNA خوانده ، آن را به عنوان الگوی برای ساختن رشته ی مکمل مورد استفاده قرار دهد. این پلیمراز فقط وقتی می تواند خواندن را شروع کند که رشته ی الگوی دارای پرایمر شده باشد ، یعنی قطعه ی کوچکی از آن دو رشته ای شده باشد. بنابراین برای استفاده از PCR ، باید مترادف آن قطعه ی کوچک DNA مشخص باشد.(7،6)
PCR شامل سه مرحله است:
قطعه ی دو زنجیره ای زیر برای تکثیر با PCR در نظر گرفته می شود.
́ 3AGC CGA TTA CGT ATG TTG AAT GTC GGC CCT – -́ 5
́ -TCG GCT AAT GCA TAC AAC TTA CAG CCG GGA-5 ́ 3
1) دناتوره شدن(Denaturing) : اولین مرحله در دناتوره کردن نمونه ی DNA با گرما از طریق افزایش دمای درون یک لوله تا 95 درجه ی سانتی گراد می باشد. علاوه بر DNA مورد بررسی ، این لوله ی آزمایش شامل میزان مولار زیادی از پرایمر های الیگونوکلئوتیدی ، DNA پلیمراز مقاوم به حرارت ( مانند DNA پلیمراز Taq که از باکتری Thermus aquaticus ) خالص میشود ، و چهار دی اکسی ریبونوکلئوتید می باشد. این دمای بالا برای حدود یک دقیقه حفظ می شود.
دو رشته ی DNA با استفاده از حرارت 95 تا 100 درجه ی سانتی گراد جدا می شود که طی آن پیوندهای هیدروژنی که دو رشته را به هم متصل می کنند ، شکسته می شوند و دو زنجیره ی زیر به وجود می آید:
́3AGC CGA TTA CGT ATG TTG AAT GTC GGC CCT – -́ 5
́ -TCG GCT AAT GCA TAC AAC TTA CAG CCG GGA-5 ́ 3
2) رناتوره شدن (Annealing) یا چسبیدن پرایمر: در مرحله ی دوم دمای مخلوط به آرامی تا حدود 55 درجه ی سانتی گراد پایین می آید در طی این مرحله ، پرایمر ها با توالی های مکملشان در DNA مورد مطالعه جفت می شود. با کاهش تا دمای 55 و تشکیل پیوند های هیدروژنی ، رشته ها دوباره جفت می شوند ، اما اگر دوباره در همان محلول ، دو پرایمر متعلق به انتهای ́3زنجیره وجود داشته باشد رشته ها به صورت زیر در می آیند:
́3AGC CGA TTA CGT ATG TTG AAT GTC GGC CCT – -́ 5
́ – A CAG CCG GGA-5 ́ 3
(پرایمر A ) ( پرایمر B )
́3AGC CGA TTA C – -́ 5
́ -TCG GCT AAT GCA TAC AAC TTA CAG CCG GGA-5 ́ 3
3) سنتز یا طویل شدن پرایمر (Primer Extension) : در مرحله سوم دما تا 75 درجه سانتی گراد بالا می رود که برای فعالیت DNA پلیمراز Taq که ایده آل می باشد. سنتز DNA از انتهای́ 3-هیدروکسیل مربوط به هر یک از پرایمر ها آغاز می شود. پلیمراز Taq رشته هایی را که پرایمر به آن متصل شده است ، شناسایی کرده و به آن متصل می شود. درجه حرارت مناسب برای فعالیت این آنزیم 72 درجه ی سانتی گراد می باشد ، در این دما پلمراز Taq با استفاده از 4 نوع دی اکسی نوکلئوتید یعنی
1- دای اکسی آدنوزین ́5 – تری فسفات (dATP)
2- دای اکسی سیتوزین ́5 – تری فسفات (dCTP)
3- دای اکسی گوانوزین ́5 – تری فسفات (dGTP)
4- دای اکسی تایمیدین ́5 – تری فسفات (dTTP)
که در محلول وجود دارند ، شروع به ساختن رشته های مکمل می کند و رشته های DNA به صورت زیر ساخته می شود:
́3AGC CGA TTA CGT ATG TTG AAT GTC GGC CCT – -́ 5
́ -TCG GCT AAT GCA TAC AAC TTA CAG CCG GGA-5 ́ 3
́3AGC CGA TTA CGT ATG TTG AAT GTC GGC CCT – -́ 5
́ -TCG GCT AAT GCA TAC AAC TTA CAG CCG GGA-5 ́ 3
این فرایند با رساندن مجدد دما به 95 درجه ی سانتی گراد و جدا شدن رشته ها سپس پایین آوردن دما تا 55 درجه سانتی گراد و چسبیدن پرایمر ها و بالا بردن دما تا 72 درجه ی سانتی گراد برای فعالیت پلیمراز Taq تکرار می شود و بعد از هر چرخه ، تعداد هر رشته دو برابر می شود. دستگاه تغییر دهنده ی دما ، به صورت خودکار درجه حرارت را در چرخه های متعدد (معمولا 25 چرخه) کاهش یا افزایش می دهد.(8،9،1)
هرسه مرحله در دماهای مشخص و متفاوت و در فواصل زمانی معیین انجام می شوند. چرخه ها در دستگاه تغییر دهنده ی حرارتی خودکار (Thermocyler) که حرارت لازم برای شروع هر مرحله را فراهم می کند ، تکرار می شوند. تک رشته DNA در درجه حرارتی بالاتر از دمای ذوب DNA (94 درجه ی سانتی گراد) انجام می گیرد. در این مرحله DNA الگو تک رشته ای می شود و پرایمر می تواند به تک رشته ها متصل شود. چسبیدن پرایمر ها در دمای پایین تری که معمولا 50 تا 70 درجه ی سانتی گراد است انجام می گیرد. هرچه درجه حرارت در این مرحله بیشتر باشد چسبیدن پرایمر اختصاصی تر است و احتمال اتصال اشتباهی پرایمر به DNA کاهش می یابد. در آخرین مرحله ، رشته های DNA الگو در اثر طویل شدن انتهای ́ 3 هر پرایمر ساخته می شود و دو کپی از روی DNA تک رشته شده تشکیل می گردد. این مرحله معمولا در 72 درجه سانتی گراد انجام می شود و به وسیله ی آنزیم DAN پلیمراز از Taq کاتالیز می گردد. ترکیبات این واکنش که شامل DNA الگو ، پرایمر ها ، پلیمراز های Taq ، نوکلوئوتید ها و بافر واکنش می باشد در لوله میکروفیوژ وارد می شود و چرخه های PCR در تغییر دهنده ی حرارتی انجام می گیرد.(1)
جداسازی قطعات DNA و RNA :
قطعات DNA و RNA حاصل از استخراج یکسان نبوده و دارای طولهای متفاوتی می باشند که برخی اوقات قطعات ماده ژنتیکی برای ما اهمیت دارد. که جهت جداسازی آن ها از دستگاه الکتروفورز استفاده می شود. به این صورت که در این دستگاه مواد با استفاده از بار الکتریکی شان حرکت می کنند. که مواد با مولکول ها بر اساس بارشان به سمت قطب های مخالف حرکت می کنند. DNA و RNA دارای بار منفی بوده و در الکتروفورز به سمت بار مثبت حرکت می کنند. با توجه به این که بار آن ها یکسان است ، حرکت آن ها در ژل بر اساس وزن مولکولی آن ها بوده و بر همین اساس جدا می شوند. در کنار نمونه ها در ژل ، همواره یک نمونه ی مارکر که حاوی قطعات DNA با وزن مولکولی مشخص است قرار می دهند که با توجه به آن می توان وزن قطعات نمونه مجهول را تشخیص داد.

الکترو فورز محصولات PCR :
الکتروفورز:
الکتروفورز از دو کلمه الکترو به معنای برق و فورز به معنای حمل تشکیل شده است. بطور کلی به روشی کفته می شود که به کمک آن مواد باردار ، در یک میدان الکتریکی از هم جدا می شوند. با توجه به باردار بودن پروتئین ها و اسید های نوکلئیک ، از این روش برای جدا سازی انواع آن ها استفاده می شود. اسیدهای آمینه ترکیبات بارداری هستند و لی به دلیل کوچکی اندازه تنها عمل الکتروفورز در ولتاژ بسیار بالا می تواند باعث جداسازی آنها شود و معمولا برای جدا کردن آنها از انواع روش های کروماتوگرافی استفاده می کنند. علیرغم این که عمل الکتروفورز را میتوان در مایع هم انجام داد ولی چون پس از قطع جریان ، نمونه ها جدا شده مخلوط می شوند ، این عمل را بر روی پایه ی جامد یا نیمه جامد انجام می دهند. پایه ی فوق می تواند لایه ی نازکی از استات سلولز باشد و یا به صورت ژل نشاسته ، اگارز یا اکریل آمید و … باشد. انتخاب نوع پایه بر حسب موادی که قرار است جدا شوند صورت می گیرد. به هر حال عمل نمونه گذاری معمولا در چاهک هایی که به همین منظور در ژل ایجاد شده است انجام می گردد. pH هایی برای الکتروفورز باید در نظر گرفته شود که بیشترین تفاوت در بار پروتئین هایی باید باشد که هدف جداسازی آنهاست را به وجود آورد. این pH بطور تجربی بدست می آید. با توجه به انجام گرفتن الکتروفورز در یک میدان الکتریکی باید محیط واجد مقدار کافی یون جهت هدایت الکتریکی باشد و همچنین برای این که نمونه بار مناسبی داشته باشد باید در محیطی با pH معیین و ثابت قرار گیرند که این دو خواسته با توجه به حضور بافر ها عملی است.
روش کار:
دستگاه دارای یک مولد جریان است که بر حسب احتیاج ممکن است در طول عمل الکتروفورز شدت جریان و ولتاژ را ثابت نگه دارد. الکتروفورزهای مولد جریان به تانک یا مخزن متصل هستند که این تانک حداقل از 3 قسمت تشکیل شده است. 2 مخزن کوچک تر که در آن بافر ریخته می شود ، قسمتی که پایه گذاری بر روی آن قرار می گیرد و بلاخره اتصالات الکتریکی.
وقتی پروتئین ها در بافری با pH غیر از pH ایزو الکتریک خود قرار گیرد باردار می شوند. این مولکول های باردار در میدان الکتریکی حرکت می کنند که این حرکت بستگی به تراکم بار (نسبت بار به وزن) آن مولکول ها دارد. و هرچه این تراکم بیشتر باشد مولکولها با سرعت بیشتری حرکت می کنند. برای تعیین زیر واحد ها ، جرم مولکولی و بررسی فرم طبیعی پروتئین ها از روش های مختلف الکتروفورز سود می برند. از محیط های نگه دارنده ژل پلی آکریل آمید ، مناسب ترین گزینه برای شناسایی پروتئین هاست. این ژل بی رنگ ، قابل رنگ آمیزی ، شفاف ، مقاوم به حرارت و مقاوم به تغییرات وسیع pH و واجد قدرت زیاد بافری است. مزیت مهم دیگر این ژل این است که با تغییر در غلظت آکریل آمید و بیس آکریل آمید می توان اندازه منافذ ژل را تغییر داد یعنی افزایش غلظت آکریل آمید باعث کاهش قطر منافذ ژل می شود. در نتیجه ژل به صورت غربالگر عمل میکند و در نتیجه پروتئین ها با اندازه ی مختلف ، تراکم بار یکسان به خوبی از این ژل جدا می شوند.
الکتروفورز بر اساس بار الکتریکی :
جداسازی نمونه های طبیعی بر اساس بار اندازه ی مولکول صورت می گیرد. و هر چه نسبت بار به جرم مولکولی بیشتر باشد حرکت مولکول در میدان الکتریکی بیشتر می شود. این نوع الکتروفورز زمانی انجام می شود که شکل طبیعی و فعالیت بیولوژیکی پروتئین ها حفظ شود.
الکتروفورز بر اساس جرم مولکولی:
پروتئین ها در حضور پاک کننده ی یونی دو سیل سولفات سدیم یا لوریل سولفات دناتوره شده و در حضور 2- مرکاپتو اتانول یا دی تیوترتیول باند های دی سولفیدی آن ها احیاء می شود و به صورت پلی پپتید یا ساختمان اول در می آید. SDS از ناحیه ی غیر قطبی خود با نواحی غیر قطبی رشته های پلی پپتیدی متصل می شود و به صورت ماسکی با بار منفی تمام سطح پروتئین را می پوشاند.که بار های پروتئین در مقایسه با بار منفی آن بسیار اندک است. و این در حالی است که بارهای مثبت آن را نیز خنثی می کند. در نتیجه پلی پپتید های حاصل تقریبا از نظر بار یکسان می شوند و حرکت مولکول ها در میدان الکتریکی تحت اثر جرم مولکلولی می شود.بنابراین با استفاده از نمونه های استاندارد با وزن مولکولی مشخص ، جرم مولکولی تعیین می شود.(2)
الکتروفورز در ژل اگارز:
الکتروفورز به وسیله ی ژل آگارز در حرارت اتاق در حالت افقی ، روشی استاندارد برای جداسازی قطعات DNA است. ژل آگارز در مقایسه با ژل پلی آکریل آمید ، قدرت تفکیک کمتری داشته اما محدوده ی جداسازی بیشتری دارد. قطعات DNA به اندازه ی bp 200 تا kbp 60 را می توان در غلظت های متفاوت ژل آگارز از هم جدا نمود. برای ساخت ژل آگارز ، ابتدا پودر آگارز را در بافر مناسبی که دارای EDTA است ریخته و حرارت می دهند ، تا محلول شفاف و روشنی حاصل گردد. این عمل را می توان با گذاشتن مخلوط بافر و آگارز در ماکروویو انجام داد. سپس محلول را تا 65 درجه ی سانتی گراد سرد کرده و بعد به درون قالب ژل الکتروفورز یا روی لام می ریزند تا سفت گردد. قبل از ریختن آگارز یک شانه ی پلاستیکی را روی لام یا درون قالب ژل آگارز قرار می دهند. این عمل بدان جهت انجام می شود تا دندانه های شانه ، چاهک های کوچکی را در آگارز قبل از سفت شدن تشکیل دهد. برای تعیین فاصله ی دندانه های شانه تا کف ظرف قالب می توان لامی را در زیر دندان های شانه قرار داد و پس از تنظیم ، لام را برداشته و آگارز را اضافه کرد. زمانی که آگارز سفت شد ماتریکس ضخیمی را تشکیل می دهد که به مقدار غلظت آگارز بستگی دارد. سپس DNA مورد نظر به درون چاهک ها وارد می شود. هنگامی که جریان برق از میان ژل عبور کند DNA که بار منفی در pH خنثی دارد به طرف کاتد حرکت می کند. میزان مهاجرت DNA در ژل به عوامل زیر بستگی دارد:

1- اندازه DNA : مولکولهای بزرگتر ، آهسته تر از مولکول های کوچکتر در زمان یکسان عبور می کنند.

2- غلظت آگارز: اندازه های مساوی از مولکول های خطی DNA با سرعت های متفاوتی در غلظت های مختلفی از ژل آگارز حرکت می کند.

3- شکل فضایی DNA : مولکلول های سوپر هیلیکال ، حلقوی و خطی DNA با اندازه های یکسان در ژلی با غلظت مشخص با سرعت های متفاوتی حرکت می کند. اشکال مختلف به ترتیب متفاوتی حرکت می کنند که به شرایط موجود بستگی داردو هنگامی که ژل سفت شد نمونه ها به آن اضافه گردد. دستگاه تنظیم برق را وصل کرده تا جریان برق بر قرار گردد. ضروری است که جهت صحیح الکترود ها رعایت شود وگرنه DNA در جهت اشتباه حرکت خواهد کرد.

توجه: قسمتی که نمونه ها در آن قرار دارد به قطب منفی و بخش مخالف آن به قطب مثبت وصل شود. نمونه با مقداری از رنگ نشانگر (Loding buffer) مخلوط می شود. این رنگ از دو جزء تشکیل شده که در دادن اطلاعات تخمینی مبنی بر حرکت نمونه ی حاوی DNA در ژل مفید می باشد. یک جزء یعنی سیانو گزیلین (به رنگ سبز) در اندازه ای حدود kb 4 حرکت می نماید ، در صورتی که جزء دیگر برومو فنل بلو (رنگ آبی تیره) در اندازه ی حدود bp 400 حرکت می کند. از این رنگ ها می توان به عنوان راهنما برای زمان مناسب انجام آزمایش بر روی ژل استفاده نمود. پس از انجام عمل الکتروفورز برای مشاهده ی DNA باید رنگ آمیزی ژل با اتیدیو بروماید (EtBr) انجام گیرد. این رنگ بین بازهای دو زنجیر DNA نفوذ می کند و در زیر نور التراویولت به رنگ قرمز-نارنجی فلورسنس مشاهده می گردد. مقدار اتیدیوم بروماید مورد استفاده در ازای قطعه ی DNA بستگی دارد. بعد از انجام الکتروفورز ، ژل در محلول اتیدیوم بروماید ، رنگ آمیزی شده و سپس با آب مقطر شست و شو داده می شود تا رنگ متصل نشده به DNA که به درون ژل وارد شده ، حذف گردد. سپس از آن ژل ، عکس برداری می شود.

روش:

1- ژل آگارز را با غلظت مورد نیاز جهت انجام الکتروفورز تهیه کنید. برای مثال 3/0 گرم را در 30 میلی لیتر (غلظت 1 درصد) از محلول TAE ریخته بعد آن را وزن کرده و درون ماکروویو گذاشته تا خوب حل شود. دوباره وزن کرده و مقدار آب بخار شده را با افزودن آب مقطر جبران کنید. سپس آن را درون قالب ژل الکتروفورز که حاوی شانه می باشد بریزید. شان باید مختصری بالاتر از کف ظرف قالب و در یک طرف باشد.
2- برای تهیه ی ژل کوچک می توان از لام استفاده کرد. برای انجام آن محلول آگارز را تا 50 درجه ی سانتی گراد سرد کرده و به آرامی و با دقت آن را روی سطح لام بریزید. توجه داشته باشید که شانه مختصری از سطح لام بالاتر باشد.
3- باید دقت شود که حباب هوا ایجاد نشود. مدت زمان بستن ژل حدو 20 تا 30 دقیقه می باشد.
4- برخی از پژوهشگران ، قبل از ریختن ژل در روی لام یا درون قالب ژل ، مقدار 5/. میکروگرم در میلی لیتر از اتدیوم بروماید را به آن اضافه می کنند. در این حالت ، باندهای DNA در هنگام الکتروفورز ، رنگ را به خود می گیرد. این عمل به علت آلودگی ظروف با اتدیوم بروماید که ماده ی خطرناکی است مورد تایید قرار نگرفته و بهتر است که انجام نشود.
5- هنگامی که ژل به درون قالب ژل الکتروفورز ریخته شد حدود 20 تا 30 دقیقه بعد ( زمانی که ژل بسته شد) ژل را با مقدار کمی از بافر TAE بپوشانید و سپس شانه را بردارید.
6- پس از این که اطمینان حاصل شد که نمونه مورد نظر حاوی ماده ی نشانگر (Loding Buffer)می باشد آن را به درون چاهک های ژل وارد کنید. در این حالت ، 20 میکرولیتر از نمونه را با 2 میکرولیتر از LB در درون یک لوله اپندروف یا در روی سطح کیسه ی پلاستیکی مخلوط کنید. سپس ، مواد اضافه را در یخچال قرار دهید. در ضمن ، سعی شود که اندازه ی مارکر متناسب با اندازه ی DNA موجود در نمونه باشد. لودینگ بافر دارای گلیسرول یا ساکارز یا فایکول یا SDS به همراه یک رنگ ردیابی کننده (برومو فنیل یا گزیلن سیانول) است.

دو خاصیت لودینگ بافر:

الف) چون به هنگام قرار دادن نمونه ، ژل درون Runnig بافر غوطه ور است ، نمونه باید به اندازه کافی سنگین باشد تا مستقیم به ته چاهک ریخته شده و پخش نشود. در حقیقت ، علت وجود گلیسرول ، نمونه سنگین می شود.
ب) وجود رنگ باعث می شود که پایان عمل الکتروفورز مشخص گردد. زیرا مولکول برومو فنل سبک تر از ماده ی ژنتیکی است ، بنابراین زودتر از تمام ماده ی ژنتیکی به انتهای ژل می رید. قبل از این که برومو فنل بلو از ژل خارج شود باید عمل الکتروفورز را متوقف کرد.
7- الکترود را وصل کنید و دستگاه تنظیم برق را روشن کنید. در ابتدا با ولتاژ 150 ولت کار کنید تا DNA شروع به حرکت به درون ژل کند. هنگامی که رنگ به داخل ژل وارد شد ولتاژ را تا 70 الی 100 ولت تنظیم کنید. مدت زمان انجام الکتروفورز طبق تجربه بدست می آید. سیم قرمز که نشانه ی مثبت بودن بار الکتریکی است در پایین و سیم سیاه که نشانه ای از بار منفی است در کنار سوراخ های ژل قرار می گیرد.
8- ژل را در آورده و در محلول اتیدیوم بروماید به مدت 20 دقیقه قرار دهید. سپس ژل را در آورده ، درون ظرفی گذاشته با آب مقطر شست و شو دهید. ژل را بر روی صفحه ی دستگاه دارای لامپ UV با طول موج 254 نانومتر در اتاق تاریک قرار دهید. اشعه ی UV ، ضمن عبور از ژل باعث نمایان شدن باندهای DNA می شود. باندهای DNA به صورت نوارهای قرمز – نارنجی فلورسنس رنگ گرفته در امتداد چاهک ها مشاهده می شود ، بعد عکس بگیرید.

یاد آوری:
v برخی از پژوهشگران به جای TAE از TBE استفاده می کنند.
v در حین بر قراری جریان الکتریکی ، دست زدن به ژل یا تانک حاوی مواد و ژل خطر برق گرفتگی وجود دارد.
v حتما از دست کش استفاده کنید ، زیرا اتیدیوم بروماید سرطان زا می باشد.
v برای مشاهده و عکس گرفتن از ژل باید اتاق تاریک باشد. از عینک و کلاه نیز استفاده شود.
v با قاشقی از جنس پلاستیک باید ژل را در روی صفحه ی دستگاه دارای لامپ UV جا به جا کنید.
بافر الکتروفورز
1- بافرTAE
2- 40 mM tris
3- اسید استیک گلاشیال (./12 % (v/v))
4- 1.5 mM EDTA
بافر 10 * TAE
1- 5/60 گرم Tris
2- 3/14 گرم اسید استیک گلاشیال
3- 3/9 گرم EDTA
4- آب مقطر تا یک لیتر با pH = 8
بافر 5 * TBE
1- 54 گرم Tris
2- 6/27 گرم اسید بوریک
3- 72/3 گرم EDTA
4- آب مقطر تا یک لیتر با pH =8
در بافر تریس – بورات (بافر فوق) معمولا تفکیک بهتری انجام می شود.
بافر Loading الکتروفورز
1- از بافر زیر در اکثر موارد در آزمایشگاه ها استفاده می شود.
· برومو فنل بولو 25/0 درصد
· ساکارز40 درصد
· آب مقطر
2- بافر Loading الکتروفورز
· گلیسرول 50%
· بوموفنل بلو 25 درصد
· گزیلین سیانول 25 درصد
· آب مقطر
3- بافر Loading الکتروفورز
· برومو فنل 25/0 درصد
· گزیلین سیانول 25 درصد
· فایکول 15 درصد (نوع 400)
· آب مقطر
غلظت اتیدیوم بروماید مورد مصرف 5/0 میکروگرم در لیتر می باشد.
غلظت اتیدیوم بروماید ذخیره شده معمولا 10 میلی گرم در لیتر است که درتاریکی و در بطری های قهوه ای رنگ در حرارت اتاق نگداری می شود.(3)

منابع:
1- دکتر امتیازی گیتی ، کریمی محسن ، مبانی زیست مولکولی و مهندسی ژنتیک ، چاپ پنجم ، اصفهان: مانی ، صفحه 460-287 ، 1384
2- میر حافظ ، فلاحتی مجتبی و همکارن ، زیست شناسی سلولی ملکولی ، ویرایش جدید ، تهران: کتاب میر ، صفحه 109-106، 1386
3- نوروزی جمیله ، روش های بیولوژی مولکولی در باکتری ها ، موسسه انتشاراتی اندیشه رفیع ، چاپ اول ، صفحه 81-75 ، 1383
4- تالیف: سیدنی پرایمرز ، ترجمه: طباطبائی مجتبی و همکاران ، بیوتکنولوژی مولکولی ، انتشارات مرکز ملی تحقیقات مهندسی ژنتیک و تکنولوژی زیستی ، چاپ رودکی ، چاپ اول ، صفحه 62-59 ، زمستان 1372
5- تالیف: آر گلیگ برنارد ، جی پاسترنک جک ، ترجمه: بهروان جواد و اسماعیلی نظری زینب ، بیوتکنولوژی مولکولی ، انتشارات وزیری موسسه چاپ وانتشارات دانشگاه فردوسی مشهد ، چاپ دوم ، صفحه 167-152 ، تابستان 1385
6- F. John Burpo , A critical review of PCR primer design algorithms and crosshybridization case study , Department of Chemical Engineering, Stanford University, CA 94305 , Submitted August 11, 2001
7- Omar Bagasra and Twaina Harris , Latest Developments in In Situ PCR , Methods in Molecular Biology, vol. 334: PRINS and In Situ PCR Protocols, Second Ed. Edited by: F. Pellestor © Humana Press Inc., Totowa, NJ

8- H. B. S. M. C6rte-Real. D. R. Dixon – R W. H. Holland , Intron-targeted PCR: a new approach to survey neutral DNA polymorphism in bivalve populations , 11 March 1994 / Accepte 26 May 1994 , Marine Biology (1994) 120:407-413
9- Florence Postollec et al , Recent advances in quantitative PCR (qPCR) applications in food microbiology , Food Microbiology 28 (2011) 848e861

کار با دستگاه PCR

مراحل PCR

مرحله دناتوراسيون DNA: ‌در مرحله اول براي مدت كوتاهي (30 ثانيه) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتيگراد حرارت مي‌دهند تا دو زنجيره DNA از هم باز نشود.

مرحله پرايمر و مرحله اتصال دو قطعه نوكلئوتيدي: ‌اين قطعات معمولا از 25 – 18 باز آلي تشكيل مي‌شوند و مي‌توانند به قطعات مكمل خود كه بر روي ژن مورد نظر قرار مي‌گيرند، اتصال يابند. قطعه‌اي كه در آن PCR به تعداد زياد ساخته مي‌شود مرحله اتصال پرايمرها كوتاه بوده و در حدود 30 ثانيه در دماي 65 – 30 درجه سانتيگراد صورت مي‌گيرد.

مرحله پليمريزاسيون يا مرحله سنتز: ‌در اين مـرحلـه، با دخالت آنزيم DNA پليمراز بر روي رشـتــه DNA الـگــو و سـنـتــز DNA بــا اسـتـفـاده از نـوكـلـئـوتـيـد تـري فـسـفـات‌هـايي كه در محلول وجود دارند، صورت مي‌گيرد و براي سنتز DNA هـميشه يك رشته DNA به صورت الگو و يك قطعه پلي نوكلئوتيدي به عنوان پرايمر مورد نياز است.

ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام مي‌شود و چـرخـه ‌هاي بعدي تكرار چرخه اول است. بدين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي افزايش مي‌يابد. يعني از 20 چرخه ، ژن مورد نظر داراي بـــيــــــش از 1مـــيـــلـــيـــــون خـــــواهـــــد بـــــود كـــــه در جـدول 1‌، افـزايـش تعـداد DNA نشان داده شده است. بنابراين روش PCR روشي كارا در ازدياد يك قطعه از DNA است.

كاربردهاي مهم PCR

‌تهيـه نسخه‌هاي متعدد از يك ژن مورد نظـر: ‌گاهي براي مطالعات بيولوژي مولكولي لازم است كه يك ژن با نسخه‌هاي نسبتا زياد در دسترس باشد. بدين منظور مي‌توان با استفاده از روش PCR،‌ ژن مورد نظر را در مقايسه با بقيه ژن‌ها تكثير كرد.

‌بررسي حضور يا عدم حضور يك ژن: ‌با استفاده از اين روش مي‌توان تشخيص داد كه آيا يك ژن در يك سلول حضور دارد يا نه؟ گاهي نيز از اين مطالعات براي بررسي وجود ژن‌هاي مختلف باكتري‌ها يا ويروس‌ها در بدن افراد استفاده مي‌كنند.

‌تشخيص بيماري‌هاي قبل از تولد: با استفاده از PCR و به كار گرفتن پرايمرهاي مربوط به يك ژن بيمار و پرايمرهاي مربوط به ژن سالم آن، مي‌توان از تولد كودكان داراي بيماري‌هاي ژنتيكي جلوگيري كرد. براي اين كار بعد از لقاح تخمك در آزمايشگاه و بعد از رسيدن تخمك به حالت 10 سلولي، يك سلول را جدا كرده و با استفاده از پرايمرها از ژن مورد نظر PCR صورت مي‌گيرد. اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تكثير پيدا كرد، اين مفهوم هموزيگوت بودن سلول‌هاي جنيني و سالم بودن آن‌ها است.

‌تشخيـص عامل يك بيماري ناشناخته: ‌فرض كنيد بيمار شما به يك بيماري نا‌شناخته گرفتار است و شما احتمال مي دهيد كه عامل بيماري ويروس است. اين ويروس را نمي شود در آزمايشگاه كشت داد بنابراين با روش PCRمي توان احتمال اين ويروس را در عرض 1 ساعت كنترل كرد. يعني نمونه اي از بدن بيمار و همچنين قطعه‌اي از ژن اين ويروس را كه پرايمر نام دارد به دستگاه مي دهيم. اگر حتي فقط 1 عدد از اين ويروس در نمونه بيمار باشد دستگاه از ژن آن ميليارد ها كپي تهيه مي كند. سپس مي توان اين حجم زياد ژن را در صفحه فيلم فلورسنت حاصل از الكتروفروز مشاهده كرد. اگر باند هاي DNAروي ژن ديده شد مطمئن مي شويد كه بيمار ناقل اين ويروس است.

‌تعيين جنسيت جنين: به طور معمول چند تخمك با چند اسپرم در آزمايشگاه لقاح مي‌يابند و سپس اجازه تكثير به سلول تخم داده و با رسيدن تخم به مرحله ده سلولي، يكي از سلول‌ها را جدا كرده و به وسيله پرايمرهاي ويژه مربوط به كروموزوم y مورد PCR قرار مي‌گيرد. كروموزوم y منحصرا در سلول‌هاي نر ديده مي‌شود. اگر قطعه توليد نشده در PCR به وسيله الكتروفورز و به طور دقيق‌تر توسط ساترن بلوتينگ تشخيص داده شد، جنين از نوع پسر و در غير اين صورت داراي كروموزوم‌هاي xx خواهد بود.

تشخيص بيماري ها
كشت ميكروب ها كه جهت تشخيص بيماري‌هاي عفوني در بيشتر آزمايشگاه ها به كار مي‌رود زمان ‌بر بوده و همچنين باعث افزايش تعداد ميكروب ‌هاي بيماري زا و غير‌بيماري‌زا در شرايط آزمايشگاهي مي شود. امروزه در برخي آزمايشگاه ها روش PCR جايگزين روش‌هاي كشت شده است. يعني قطعه ‌اي از ژن مربوط به ميكروب بيماري زا مورد شناسايي قرار گرفته و پرايمرهاي مربوط توليد مي ‌شوند. با استفاده از اين پرايمرها مي ‌توان تشخيص داد كه آيا مثلا ويروس ايدز در داخل بدن وجود دارد يا نه؟
از ديگر موارد استفاده از PCR مي توان، مطالعه نسبت خويشاوندي در تفحص شهدا، تشخيص بيماري هاي ژنتيكي در اثر ازدواج هاي فاميلي، تعيين هويت، تعيين سن و قد، جـرم شنـاسـي از طـريـق آثار باقيمانده از قاتل، تكثير ژن براي ايجاد آنزيم، تشخيص سرطان‌ها و ايجاد جهش هاي هدف دار را نام برد.

مواد لازم PCR

1. بافر PCR: شرايط يوني ph مناسب را براي واكنش PCR فراهم مي كند. بافر به صورت x10 ساخته مي شود. اين بافر داراي گليسيرول براي سنگيني كار و داراي رنگ براي مشهود سازي DNA است.

2. دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات: كه به صورت مخلوطي از چهار باز در بازار وجوددارد تا كنار هم چيده شوند و رشته مكمل را ايجاد كنند .

3. آغازگرها primer : پرايمرها قطعات سنتز شده اي از بازهاي آلي اند كه بر اساس قطعه مورد نظر الگوهاي هدف ساخته مي شوند كه معمولا با طول 3015 نوكلئوتيد هستند كه به DNA الگو متصل مي شوند. طول پرايمرها بسيار مهم است و هر چه طول پرايمر بلند باشد اختصاصي تر عمل مي كند.
پرايمرها دو عمل انجام مي دهند. اول اين كه محل ژني را كه بايد تكثير شود مشخص مي‌كنند و دوم اين كه اندازه قطعات تكثير شونده را تعيين مي كنند. بايد توجه داشت دو پرايمر داراي نقطه ذوب نزديك به هم باشند. پرايمر مورد نظر توسط كامپيوتر انتخاب مي شود.
4. Tag DNA polymerase: يك آنزيم مقاوم به دما است كه همانند سازي DNA را انجام مي‌دهد. آنزيم Tag پليمراز باعث مي شود به راحتي واكنش PCR به طور اتوماتيك انجام شود .
5. 2Mgclكلريد منيزيم نقش كوفاكتوري در فعاليت آنزيم Tag دارد. اثر متقابل رشته DNA الـگــو و آغـازگـر را افـزايـش مـي دهـد. غلظـت كلـريـدمنيـزيـم اثـر زيـادي بـرروي اختصاصي شدن و در نهايت بازده واكنش PCR دارد. غلظت زياد آن اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم تگ DNA پلي مراز دارد و مقدار محصول نهايي را كاهش مي دهد.
6. دي ان آ الگو Template DNA : بسته به هدف آزمايش از منابع مورد نياز با استفاده از يكي از روش هاي مرسوم استخراج مي شود. معمولا به ازاي هر واكنش 5% واحد يا 1% ميكرو ليتر استفاده مي شود .
7. لوله هاي واكنش : لوله هاي كوچك 5% ميلي ليتر
8. سمپلر و سر سمپلرهاي يكبار مصرف مخصوص آن ها كه براي برداشتن مقادير بسيار كم استفاده مي شود.
9. دستگاه چرخش حرارتي
10. ميكرو فيوژ
11. روغن معدني mineral oil: يك قطره روي مخلوط واكنش اضافه مي شود تا از تبخير نمونه در دستگاه چرخش حرارتي thermal cycler جلوگيري مي شود. معمولا 50 تا 60 ميكروليتر به محلول واكنش 100 ميكروليتري اضافه مي شود .

مشكل PCR و راه حل آن

اشكال PCR ، آلودگي نمونه‌هاي مورد بررسي توسط قطعات DNA خارجي است. اگر قبلا در داخل دستگاهي PCR يك نمونه انجام گرفته باشد، و ذره كوچكي از آن در داخل دستگاه باقي بماند در PCR نمونه بعدي مشكل ايجاد خواهد كرد. براي رفع مشكل، امروزه از ظروف يك بار مصرف استفاده مي‌شود. كليه ظروف قبل از استفاده اتوكلاو مي‌شوند تا سلول‌ها و مولكول هاي موجود در آن ها، تا حد ممكن غير فعال مي‌شوند.
يـكــي از روش‌هــاي پـيـشـنهـادي انجـام PCR داخـلــي يـا Nested PCR اسـت. از ايـن روش بـا استفـاده از دو پرايمر قطعه‌اي از DNA را تكثير مــي‌دهـنــد و سـپــس قـطـعــه‌اي ديـگــر در داخـل DNAهــاي تـكـثـيــر شــده PCR مــي‌شــود. بــديــن صورت احتمال آلودگي كاهش مي‌يابد.

اساس کار PCR

آزمایش واکنش زنجیره ای پلی مراز (Polymerase Chain Reaction) یا به اختصار PCR، در حقیقت یک دستگاه تکثیر DNA و یا RNA می باشد که همانند یک موتور محرک سرعت پیشرفت تحقیقات ژنتیکی-مولکولی را افزایش داده است. ايده راه اندازي PCR در سال 1983 توسط Mulis ارائه شده و اولين آزمايشهاي عملي آن در شركت Cetus انجام گردید. این تكنيک كه بصورت گسترده در بيولوژي ملكولي و تمامي آزمايشگاه هاي تحقيقاتي زيست شناسي و تشخيص بيماري هاي خاص ژنتيكي در آزمايشگاه هاي ژنتيك،تشخيص سرطان و تشخيص بيماريهايي كه در آنها سرعت و دقت نقش مهمي دارند كاربرد دارد. همچنین اين روش در تشخيص انواع بیماریهای انسان و دام شامل دامهای بزرگ، طیور و حتی آبزیان در اغلب آزمایشگاههای تشخیص طبی بطور رایچ انجام می شود.
در روش PCR، با استفاده از اجزاي همانند سازي طبيعي DNA نظیر Oligo nucleotide primer و Taq-DNA polymerase در تیوب، DNA تكثير مي گردد. در این آزمایش در يك محیط بافري ساده، ناحيه خاصي از ملكول DNA الگو یا به اصطلاح Template، به وسيله يك آنزیم DNA پلي مراز، بر اساس قوانین شیمیایی جفت شدن بازها، مولکولهای دي اكسي نوكلئوتيد نظیر بلوكهاي ساختماني، جهت ایجاد رشته جديد DNA ایجاد شده و پیوند می یابند. اساس PCR استفاده از دماهاي مختلف در یک واکنش سه مرحله ای مي باشد. معمولاً درمرحله اول(تقليب)، در دماي 95-94 درجه، جداشدن رشته هاي DNA الگو انجام می شود، سپس دما در جهت اتصال پرايمرها به توالي مكمل بر روي رشته الگو در حد 72-40 درجه پايين آورده شده كه اين دما بستگي به پرايمرهاي مورد استفاده دارد و نهايتاً براي ساخت DNA ، دما در حد دماي مطلوب فعالیت آنزیم DNA پلي مراز تنظيم مي شود. جهت تكثير DNA هدف، لازم است كه اين سه مرحله دمایی طي چندين چرخه تكرار شود كه اين كار توسط دستگاه ترموسايكلر (Thermocycler) انجام مي گردد. تقريباً در همه سیستمهاي PCR از يك DNA پلي مراز مقاوم به حرارت استفاده که یکی از رایج ترین آنها آنزیم polymerase Taq است. این آنزیم، از باكتري Thermus aquaticus استخراج شده است.

مرحله اول : مرحله تقلیب (Denaturation) (تقلیب):
پیوندهای هیدروژنی بین جفت بازهای DNA دو رشته ای در دمای حدود 94 درجه سانتی گراد از هم جدا شده و هر رشته از DNA اولیه به عنوان الگوی ساخت یک رشته مکمل جدید استفاده می شود. این مرحله تکثیر، بر اساس توانایی نوکلئوتید ها برای جفت شدن با باز مقابل خود، طبق قانون واتسون-کریک که همیشه Aبا T و G با C جفت می شوند، استوار است. بنابر این رشته الگوهمیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

مرحله دوم: اتصال (Anealing ): با پایین آوردن دما تا 72الی40 درجه سانتی گراد، پرایمرهای الیگو نوکلئوتیدی اختصاصی که بر اساس قوانین کلی جفت شدن بازها به رشته DNA الگو متصل می شوند، ناحیه مورد نظر از DNA الگو را جهت تکثیر مشخص کرده و نهایتا DNA پلی مراز با اضافه کردن دی اکسی نوکلئوتید ها بر روی عامل 3-OH پرایمرها، ملکولهای جدید از روی هر دو رشته را در امتداد هم قرار می دهد. طی مرحله اتصال، DNA پلی مراز مقاوم به حرارت (Taq) فعال بوده و به محض اتصال پرایمرها به DNA الگو، افزایش طول آنها را آغاز خواهد کرد.

مرحله سوم: در این مرحله، واکنش تا رسیدن به دمای بهینه فعالیت آنزیم پلی مراز که در حدود 72 درجه می باشد، افزایش می یابد و در اولین چرخه به ازای هر رشته الگو، یک DNAدو رشته ای جدید ایجاد می شود. به این ترتیب تعداد نسخه های ناحیه هدف 2 برابر می گردد و به همین صورت در هر چرخه، تعداد نسخه های رشته DNA هدف ، 2 برابر می شود. اگر بازده PCR به 100% برسد، در طی 20 چرخه واکنش PCR، DNA هدف به میزان یک میلیون برابر تکثیر خواهد شد که البته معمولاً تکثیر به میزان 105 برابر یا بیشتر انجام می شود.

پس از اتمام مراحل تكثير DNA ، يكي از رايجترين و سريعترين روشهاي بررسي محصولات PCR، روش الكتروفورز روی ژل آگاروز مي باشد. در این روش، اغلب محصول نهایی واکنش PCR، با نسیت حجمی 1:10 يا 1:5، بر روي ژل آگارز 0.8 تا %3 برده مي شود. براي كمك به قرار دادن نمونه بر روي ژل و ديدن حركت نمونه درون ژل، بايد مقداري Loading buffer حاوي گليسرول و رنگ شاخصي همانند بروموفنل بلو ، به نمونه های فوق اضافه می شود. اگر PCR در شرايط خوبي انجام شده باشد بايد باند قوي و باريكی مشاهده گردد. در برخي از موارد تمايز بين محصولات تكثير اختصاصي و غير اختصاصي مشكل مي باشد كه ممكن است به علت غلظت مشابه باندها و يا اسميري از محصولات غير اختصاصي تكثير DNA باشد كه مي تواند به علت كيفيت پايين DNA يا پايين بودن تعداد نسخه هاي الگو و يا تركيبي از اين عوامل رخ دهد.
تصاوير زير مراحل الكتروفورز را نشان مي دهند:

نمونه ای از تصویر نهایی حرکت محصول PCR در الکتروفورز

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)، تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود. این قطعه DNA ممکن است یک ژن، بخشی از یک کروموزوم یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد. البته در تکثیر DNA با روش PCR محدودیت هایی نیز وجود دارد که مهمترین آنها اندازه قطعات قابل تکثیر می باشد به طوری که حداکثر اندازه قطعه هایی که با روش PCR معمولی تکثیر می گردد، 5 هزار نوکلئوتید (kb 5) و در روش های بهینه شده تا 20 هزار نوکلئوتید (kb 20) می باشد.

با این تعریف، PCR همانند یک دستگاه فتوکپی عمل می کند که بوسیله آن می توان صفحاتی از کتاب ژنوم هر موجود را به تعداد دلخواه و مشابه نسخه اصلی (البته در مواردی همراه با خطاهای جزئی) تکثیر نمود.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

مخترع واکنش PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می باشد که در سال 1983 این روش را جهت تکثیر DNA معرفی کرد. قبل از این کشف، ساخت قطعات DNA با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت. به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت کرد.

واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل شناسایی و جداسازی ژن ها، کلونینگ، طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده، تشخیص بیماری های ژنتیکی و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد. در حال حاضر و نزدیک به 30 سال پس از کشف PCR، تحقیقات ژنتیک مولکولی بدون استفاده از این تکنیک قابل تصور نیست.

سازوکار (برنامه) واکنش PCR
اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (94-95 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید، کاری که در همانند سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می گیرد. در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می پذیرد. مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA
مرحله دوم: اتصال (Annealing)، 30 تا 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA
مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر
این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

اجزا واکنش PCR
در یک واکنش PCR از نمونه DNA، آنزیم Taq polymerase، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها و آب حضور استفاده می شود. توضیحات مربوط به هر یک از این اجزا در ادامه ارائه شده است:

– نمونه DNA (الگو)
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

– آنزیم Taq polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

– نوکلئوتید ها
چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

– بافر
مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

– یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیم DNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود.

غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

– پرایمرها
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و مرحله بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد. دمای مرحله اتصال در برنامه PCR به توالی پرایمرها ارتباط دارد.

وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR
حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR، دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی)، میکرو پیپت، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند تیپ (جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود) و ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها می باشد.

دستگاه ترموسایکلر برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر، قابل برنامه ریزی می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

میکرو پیپت برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرو لیتر استفاده می شود. بر روی این دستگاه که کار کردن با آن بسیار راحت است، تیپ های یک بار مصرف قرار داده می شود و بدین وسیله حجم مورد نظر از آن برداشته و به واکنش PCR افزوده می شود.

نوشته: کسری اصفهانی

روش‌های سنجش با Real-Time PCR

به طور کلی دو روش برای انجام PCR کمی با استفاده از Real-Time PCR داریم: 1- سنجش غیراختصاصی 2- سنجش اختصاصی شامل : الف- Hydrolysis Probes که به سه نوع Taq man، Beacons و Scorpions تقسیم می‌شود.
1- سنجش غیر اختصاصی

این روش با استفاده عوامل متصل شونده به DNA مثل SYBR Green انجام می‌شود. این رنگ از طریق جایگزینی در شیار کوچک DNA به DNA متصل می‌شود.
از جمله مزایای این روش ارزان، راحت و حساس بودن آن است. یکی از معایب بزرگ آن این است که با اتصال به دورشتة‌هایی مثل پرایمر دایمر و دیگر باندهای غیراختصاصی، نتایج بیشتر از غلظت اصلی برآورد می‌شود و بنابراین بهینه کردن آن باید به صورتی باشد که کمترین مقدار پرایمر دایمر و محصول غیراختصاصی ایجاد گردد.
به همین دلیل به این نوع از PCR واکنش غیراختصاصی می‌گویند.
شکل بالا نشان می‌دهد در واکنش PCR هنگامی که DNA به صورت واسرشت (Denaturate) در می‌آید، سایبرگرین به DNA متصل نمی‌شود، اما در مرحلة Annealing و تکثیر DNA ، همزمان با دورشته‌ای شدن DNA سایبرگرین در ساختار آن قرار می‌گیرد. به این ترتیب با افزایش DNAهای دورشته‌ای مقدار سایبرگرین متصل شده نیز افزایش می‌یابد و درنتیجه نور فلورسانت بیشتری ساطع می‌شود که شدت نور توسط دستگاه قابل اندازه‌گیری است.
در شکل زیر نیز مکانیسم عمل سایبرگرین به عنوان یک عامل متصل شونده به DNA نشان داده شده است:

از جمله مزایای Real-Time PCR ترسیم منحنی ذوب (Melt Curve Analysis) است که پس از اتمام فرآیند PCR ترسیم و برای تایید نتایج استفاده می‌شود. دمای ذوب DNA یک پارامتر ویژه برای این مولکول است که به ساختمان آن و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلئوتید، غلظت پروب، میزان نمک محیط و درصد GC ؟ بستگی دارد.
از آنجایی که سایبرگرین نمی‌تواند بین محصولات مختلف تمایز بدهد (به همین دلیل به این نوع از PCR واکنش غیراختصاصی می‌گویند، دلیل دیگر غیراختصاصی بودن روش‌هایی نظیر سایبرگرین، عدم وجود پروب در واکنش است، زیرا پروب می‌تواند به عنوان یک پرایمر ثانویه باشد که مخصوص توالی طراحی شده است، توضیحات بیشتر در روش Taq man آورده می‌شود)، می‌توان با استفاده از منحنی ذوب تنوع محصولات PCR را مشخص کرد.
بعد از اینکه PCR به پایان رسید، دستگاه قادر است نمودار ذوب هر نمونه را رسم کند. این کار بوسیلة اندازه‌گیری تغییرات فلورسانس در دماهای مختلف صورت می‌گیرد. مراحل انجام کار به این ترتیب است که برای رسم منحنی، دستگاه دمای نمونه‌ها را در فواصل زمانی مشخص (مثلا هر 10 ثانیه) به مقدار معینی تغییر می‌دهد. یعنی ابتدا دستگاه دمای نمونه‌ها را مثلا به 94 درجه سانتیگراد می‌رساند، در این حالت تمام DNAها به صورت تک‌رشته‌ای هستند و میزان سایبرگرین متصل شده حداقل است. در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم می‌باشد. به تدریج دستگاه دمای نمونه‌ها را 5/0 درجه سانتیگراد کاهش داده و 10 ثانیه در آن دما ثابت می‌ماند و در این مدت نور ساطع شده از نمونه‌ها را اندازه‌گیری می‌کند. همزمان با این عمل منحنی تغییرات فلورسانس بر حسب دما – که همان منحنی ذوب است- ترسیم می‌گردد.
در نقطة ذوب (Tm) 50% پیوندهای هیدروژنی در DNAهای دورشته‌ای از هم جدا می‌شوند و میزان فلورسانس به طور ناگهانی تغییر می‌یابد.

در این منحنی هر یک از قله‌ها نمایانگر Tm یک محصول PCR است. بنابراین با تحلیل منحنی ذوب می‌توان وجود باندهای غیراختصاصی و دایمر پرایمر را تشخیص داد.
نرم‌افزار، سرعت تغییرات را به صورت Relative Fluorescence Unite یا RFU در محور y و دمای دستگاه را در محور x نشان می‌دهد.
پس از مشتق‌گیری از نمودار مقابل، منحنی درجه دومی بدست می‌آید که در این منحنی هر قله نمایانگر یک محصول PCR است. قله‌هایی که در دماهای پایین‌تر هستند، نشان دهندة قطعات کوچکتر هستند.

در منحنی ذوب فوق همة نمونه‌ها بوسیلة یک جفت پرایمر یکسان تکثیر شده‌اند. نمونه‌ای که با خط قرمز مشخص شده (پایین‌ترین قله) نمونه کنترل می‌باشد که فاقد DNA الگو است و Tm پایین این نمونه نشانگر وجود دایمر پرایمر می‌باشد.
در انتهای کار دستگاه با استفاده از پروب TaqMan نمودار منحنی ذوب رسم می‌شود که چند نکته در هنگام تحلیل و بررسی نمودار حتما باید در نظر گرفته شود.

همانطور که گفته شد، دستگاه بعد از پایان کار منحنی ذوب را ترسیم می‌کند که محور افقی این منحنی دما و محور عمودی آن میزان فلورسنت قابل ردیابی می‌باشد و براساس این منحنی ما می‌توانیم مقدار و اندازة قطعات تکثیر شده را بسنجیم. به این صورت که هرچه میزان فلورسنت قابل ردیابی کمتر باشد، قلة تشکیل شده کوتاه‌تر است و بنابراین میزان تکثیر آن قطعه هم کمتر بوده که سایبرگرین کمتری به آن متصل شده است. اما در مورد اندازه ی قطعات، هرچه قله در دمای پایین‌تری تشکیل شود، Tm قطعه کمتر بوده و معمولا باند غیراختصاصی ما در این محدوده قرار می‌گیرد. نمودارهای زیر این مطلب را به خوبی روشن می‌کنند:

2- سنجش اختصاصی
الف- Hydrolysis Probe Technique :
این نوع از واکنش Real-Time به 3 دسته تقسیم می‌شود. در این روش از مکانیسم سیستم انتقال انرژی فلورسانس یا FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) استفاده می‌شود.
در این مجموعه پروب‌ها طوری طراحی می‌شوند که در ابتدای پروب یک رنگ فلورسانس به نام Reporter و در انتهای آن فلورسانس دیگری به نام Quencher قرار می‌گیرد. وقتی که Reporter و Quencher در حالت اتصال به پروب و در فاصلة نزدیک به هم قرار دارند، نوری که به Reporter می‌خورد، باعث ایجاد یک تابش (Emission) می‌شود که این تابش در ناحیة تحریک Quencher است، بنابراین Quencher این نور را جذب کرده و تابشی در طول موج بلندتر که قابل ارزیابی توسط دستگاه نمی‌باشد، ساطع می‌کند. اما پس از جدایی Reporter از Quencher نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نیست و توسط دستگاه به صورت فلورسانس قابل اندازه‌گیری است.

P روش Taq Man Probe
اساس این روش خاصیت 5´ Exonuclease آنزیم Taq DNA Polymerase می‌باشد. در پروب Taq Man یک Reporter در انتهای ´5 و یک Quencher در انتهای ´3 وجود دارد. همچنین در انتهای ´3 یک مسدود کننده (blocker) هم وجود دارد، تا پروب به عنوان پرایمر استفاده نشود. پروب حدود چند باز بعد از انتهای ´3 پرایمر روبه‌جلو قرار می‌گیرد و طول آن 30-20 نوکلئوتید است.
در این نوع واکنش PCR برایس اتصال کامل پروب، به غلظت بیشتری از MgCl2 نیاز است.
آنزیم پس از نزدیک شدن به پروب با استفاده از خاصیت اگزونوکلئازی ´5 خود، پروب را لیز می‌کند و وقتی پروب تجزیه شد، Reporter از تاثیر Quencher خارج می‌شود و فلورسانس تابش شده از آن توسط Quencher قابل جذب نیست. بنابراین در هر دوره با آزاد شدن بیشتر Reporter ماده فلورسانس بیشتری تابش شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود.

نمودار بالا نشان می‌دهد که میزان افزایش فلورسانس Reporter با میزان محصول تولید شده ارتباط مستقسم دارد. در هر دوره با آزاد شدن بیشتر Reporter ، ماده فلورسانس بیشتری تابش ساطع شده و توسط دستگاه ثبت می‌شود.
P روش Beacones Probe
این پروب نیز همانند پروب Taq Man دارای رنگ در انتهای ′3 و ′5 می‌باشد، اما برخلاف Taq Man تجزیه نمی‌شود و در سیکل‌های بعدی دوباره استفاده می‌شود. این پروب قبل از اتصال به DNA به صورت حلقه است که به آن Stemloop structure می‌گویند.
به علت نزدیکی Reporter و Quencher نور ساطع شده از Reporter توسط Quencher مهار می‌شود. پس از اتصال پروب به محل مورد نظر خود، ساختار Stemloop باز شده و در نتیجه رنگ‌ها از هم دور می‌شوند و تابش نور از Reporter انجام می‌گیرد.

ü روش Scorpion Primers
توالی پروب طوری طراحی شده که مکمل تعدادی از نوکلئوتیدها بعد از پرایمر Forward است. دو طرف پروب شامل توالی شش نوکلئوتیدی است که در دمای محیط ایجاد duplex می‌کند. انتهای ′5 ساقه به صورت کووالان به Reporter و انتهای ′3 به Quencher متصل می‌باشد. هنگامی که پروب به صورت duplex است، نور ساطع نمی‌شود. یک بلاکر نیز از تکثیر پروب توسط پرایمر Reverse در چرخة بعدی PCR جلوگیری می‌کند. جهت‌گیری پروب به صورتی است که انتهای ′5 آن مکمل انتهای ′3 Target می‌باشد.
در طول چرخه‌های PCR همزمان با اتصال پرایمرها،‌لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخة قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporter از Quencher نور ساطع می‌شود. در مرحلة بعد پروب از Tamplate جدا شده و به حالت خاموش در می‌آید. به این ترتیب در هر annealing با افزایش محصول PCR مقدار فلورسانس نیز افزایش می‌یابد.
شکل زیر اجزای تشکیل دهندة پرایمر scorpion را نشان می دهد، همزمان با اتصال پرایمرها، لوپ پروب باز شده و به قسمت تکثیر شده از چرخه ی قبل متصل می‌شود و در نتیجه به علت جدا شدن Reporter از Quencher نور ساطع می‌شود.

ب- Hybridization Probes Technique :
در این سیستم پروب به صورت دو قطعة مختلف طراحی می‌شود. فلورسانت در انتهای ′5 یکی و در انتهای ′3 دیگری قرار دارد. وقتی که این دو دقیقا در محل مورد نظر خودشان بچسبند، نزدیکی فاصلة این دو ماده باعث واکنشی به نام FRET* می‌شود. انتخاب رنگ‌ها در این پروب به صورتی است که طول موج ساطع شده از یک پروب، به عنوان محرک پروب دیگر است. پس از چسبیدن دو پروب این رنگ‌ها به هم نزدیک شده و فلورسانس ساطع شده قابل اندازه‌گیری است.
طراحی این پروب‌ها به نحوی است که در صورت تفاوت حتی در یک نوکلئوتید، به DNA متصل نمی‌شوند. یکی از کاربردهای این پروب، تشخیص موتاسیون‌های نقطه‌ای (Single Nucleotide Polymorphism) می‌باشد. انتخاب رن
‌ها در این پروب به صورتی است که طول موج ساطع شده از یکی به عنوان محرک دیگری عمل می‌کند. پس از چسبیدن 2 پروب این رنگ‌ها به هم نزدیک شده و فلورسانس ساطع شده قابل اندازه گیری است.
طراحی این پروب‌ها به نحوی است که در صورت تفاوت حتی در یک نوکلئوتید به DNA متصل نمی‌شود. یکی از کاربردهای این پروب‌ها در تشخیص SNP می‌باشد، چون در موتاسیون‌های نقطه‌ای باز جهش یافته مکمل باز مورد نظر در پروب نیست، اتصال صورت نمی‌گیرد.
مزیت این روش نسبت به سیستم‌های شناسایی دیگر مثل ARMS این است که در ARMS (Amplification Refractory Mutation System-PCR) برای هر جهش ویژه باید یک پرایمر خاص طراحی شود. اما در FRET یک ست پروب برای نمونة نرمال تهیه می‌شود و نمونه‌های جهش یافته به علت جدا شدن زودتر پروب از ژنوم قابل شناسایی هستند.
شکل مقابل نحوة عمل این پروب‌ها را نشان می‌دهد.

* مکانیسم عمل FRET (Fluoresence Resoance Energy Transfer) :

عاملی مثل HSVI و HSVII را در نظر می‌گیریم. با استفاده از این روش می‌توان Sub Type هرپس سمپلکس ویروس در نمونة مجهول تعیین می‌شود. به این صورت که ابتدا پروب‌ها را برای HSVI طراحی می‌کنیم به نحوی که یکی از پروب‌ها به طور کامل به هر دو Sub Type متصل شود، و پروب دیگر اختصاصی برای HSVI باشد. در دمای 50 درجة سانتیگراد پروب‌ها به هر دو Sub Type می‌چسبند، اما اگر دما را تا 67 درجه بالا ببریم، پروب تنها به ژنوم HSVI متصل می‌شود و به علت وجود Mismatch در HSVII از ژنوم آن جدا می‌شود. در دماهای بالاتر (بیشتر از 70 درجة سانتیگراد) اتصال هر دو پروب از ژنوم قطع می‌شود.
در هنگام آنالیز منحنی، در منحنی HSV1 به دلیل کامل بودن اتصال، جدا شدن پروب‌ها در دمای بالاتر از 67 درجه می‌باشد، اما در HSV2 به علت وجود Mismatch پروب‌ها در دمای پایین‌تر جدا می‌شوند. بنابراین تغییرات فلورسانس در دمای پایین‌تر از 67 درجه مشاهده می‌شود. بنابراین در منجنی ذوب، قلة مربوط به HSV1 در سمت راست قلة HSV2 قرار می‌گیرد:

شکل مقابل سیستم‌های مختلف ردیابی را در Real-Time PCR نشان می دهد.

A: اتصال سایبرگرین به DNA دورشته‌ای. بیشتری اتصال در انتهای فاز Extension است که تقریبا تمام DNAها دورشته‌ای شده‌اند.
B: پروب Taq Man به عنوان مثالی از مکانیسم عمل Hydrolysis prob ها نشان داده شده است.
C: در Hybridization probe در صورت اتصال پروب‌ها به DNA نزدیکی رنگ‌ها باعث واکنشی به نام FRET می‌شود.
Multiplex Real-time PCR :
استفاده از پروب‌هایی با رنگ‌های مختلف امکان انجام Multiplex Real-time PCR را فراهم می سازد. در این حالت برای هر هدف یک پروب طراحی می‌شود که طول موج آن با بقیة پروب‌ها متفاوت است و این تفاوت توسط دستگاه قابل تشخیص است.