روش کشت پور پلیت

تئوری آزمایش

برای انجام این آزمایش به ابزار زیر نیازمندیم:
پلیت ، لوله آزمایش ، پیپت 1 سی سی ، سرم فیزیولوژی ، محیط کشت PCA ، دستگاه کلونی کانتر ، انکوباتور ، نمونه ماده غذایی

روش کار

برای انجام این آزمایش از ماده غذایی رقت های مختلفی را باید تهیه کرد. سپس توسط پیپت مقدار معینی ( 1 cc ) از هر رقت را درون پلیت ریخته و محیط کشت PCA را نیز درون پلیت ها می ریزیم ( 15cc ). به این روش کشت کلونی ها روش پور پلیت می گویند.( باید دقت داشت که دمای محیط کشت PCA از 45 درجه سانتیگراد بیشتر نباشد زیرا در غیر این صورت بر اثر حرارت محیط ، باکتری ها آسیب دیده و کلونی تشکیل نمی شود). برای مخلوط شدن محیط کشت با نمونه آلوده باید پلیت را 5 بار در جهت عقربه های ساعت و 5 بار برخلاف آن و 5 بار افقی و 5 بار عمودی پلیت را تکان دهیم یا پلیت را 5 بار به صورت هشت انگلیسی حرکت می دهیم. این کار اهمیت خاصی دارد زیرا اگر این کار به خوبی انجام نشود پراکندگی کلونی ها پس از رشد در پلیت نامنظم خواهد بود. پلیت ها را در انکوباتور 32 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت قرار داده و بعد رشد کلونی ها آنها را با دستگاه کلونی کانتر شمارش می کنیم.
برای اطمینان از استریل بودن محیط کشت و پلیت ها از محیط کشت شاهد استفاده می کنیم. در ضمن برای هر رقت باید دو پلیت آماده شود.

شمارش کلونی ها

دو روش برای شمارش کلونی ها وجود دارد:
الف) دستگاه کلونی کانتر که به طور اتوماتیک تعداد کلونی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.
ب) روش دستی که پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دارد و با علامت گذاری خانه ها تعداد را بدست می آوردند.

روش محاسبه

الف) شمارش کلی میکروبی ( محاسبه استاندارد)← جهت شمارش پلیت هایی انتخاب شوند که بین 30 تا 300 کلونی داشته باشند که برابر میانگین تعداد کلونی های شمارش شده در دو پلیت ضرب در ضریب رقت بکار رفته.
ب) محاسبه تخمینی← اگر در تمام رقت ها بیش از 300 کلونی در هر پلیت دیده شود ، سطح هر پلیت را به شعاع های مناسب تقسیم می کنیم و کلونی ها را در یک قسمت شمارش کرده و سپس تعداد کل را در ضریب مناسب ضرب می کنیم. میانگین شمارش را در دو پلیت محاسبه و در ضریب رقت ضرب و نتیجه را به عنوان تخمین شمارش کلونی گزارش می کنند.

شرح عملی آزمایش

برای انجام آزمایش ابتدا باید رقت سازی انجام داد که در اینجا سه رقت 1-10 ، 2-10 ، 3-10 را تهیه کردیم. ابتدا باید رقت 1-10 را تهیه کنیم. برای این کار مقدار 1 cc از ماده غذایی آلوده که در اینجا شیر است ، در یک لوله آزمایش استریل ریخته و 9 cc سرم فیزیولوژی را به لوله اضافه می کنیم و آن را به خوبی تکان می دهیم . حال که رقت 1-10 را ساختیم ، می توانیم سایر رقت ها را بسازیم به این ترتیب که مقدار 1cc از رقت 1-10 را با پیپت بر می داریم و درون لوله آزمایش دیگری می ریزیم و مقدار 9 cc سرم فیزیولوژی را به لوله اضافه می کنیم و رقت 2-10 تهیه می شود. برای ساختن رقت 3-10 مقدار 1 cc از محلول 2-10 را همراه با 9 cc سرم فیزیولوژی درون لوله آزمایش دیگری می ریزیم.
حال که رقت ها را تهیه کردیم ، نوبت به کشت آنها می رسد. برای هر رقت دو پلیت استریل مشخص می کنیم. از هر لوله مقدار 1ml برداشته و به داخل پلیت های مربوط به آن رقت می ریزیم ( به دلیل کمبود تعداد پیپت این کار را از رقت 3-10 شروع می کنیم و بعد رقت 2-10 و در آخر رقت 1-10 را به داخل پیپت می ریزیم ).
پس از این کار 15 cc از محیط PCA را در هر پلیت می ریزیم ( البته به علت کمبود محیط کشت PCA مقداری کمتر از 15 cc در هر پلیت ریختیم ). دمای محیط کشت نباید زیاد باشد تا میکروارگانیسم ها کشته شوند ؛ تقریبا حدود 45 تا 50 درجه سانتیگراد.
پلیت ها را 5 مرتبه به شکل 8 حرکت می دهیم تا محلول یکنواخت شود. سپس آنها را بی حرکت می گذاریم تا بسته شود و پلیت ها بر روی هم می گذاریم و با چسب به هم می چسبانیم.
پلیت ها را بعد از بسته شدن محیط کشت یا قبل از آن باید علامت گذاری کنیم که شامل رقت ، گروه ، ساعت و روز کلاس می شود.
پلیت ها را در انکوباتور 32 درجه به مدت 48 ساعت قرار دادیم. بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم. پلیت را با ماژیک به چهار قسمت تقسیم می کنیم و یکی از قسمت ها را شمارش می کنیم و در تعداد قسمت ها ضرب می کنیم و تعداد کلونی های هر رقت را بدست می آوریم.

روش کشت پور پلیت