روش الایزا (ELISA)

روش الایزا (ELISA)

الایزا چیست؟
Enzyme-linked immunosorbent assayمعروف به EIA یک تکنیک بیوشیمایی است يكي از قدرتمند ترين روش هاي آزمايشگاهي براي پي بردن به اختلالات سيستم ايمني است تا حضور آنتي‌ژن یا آنتی بادی در یک نمونه را بررسی نماید این تکنیک در پزشکی و پاتولوژی گیاهان و در کنترل کیفی صنایع خصوصا صنایع غذایی کاربرد دارد در یک تعریف ساده ELISA مقدار آنتی ژن فیکس شده در سطح یک ظرف یا پلیت است که سپس با یک آنتی بادی خاص که روی سطح ریخته می شود به آنتی ژن متصل می شود . این آنتی بادی متصل به یک آنزیم است و در مرحله نهایی ، ماده ای به ظرف اضافه می شود که آنزیم بتواند برخی سیگنال های قابل تشخیص را مثل تغییر رنگ با یک ماده شیمیایی ایجاد نماید

همچنين آنتي بادي‌هايي كه در پاسخ به برخي عفونت‌ها يا بيماري‌ها به‌وجود آمده نيز توسط اين تست قابل تشخيص هستند. تست ELISA اولين آزمايش متداول در غربال‌زني HIV است. در تست ELISA سرم فرد 400 بار رقيق شده و به صفحه اي كه حاوي آنتي‌ژن HIV است اضافه مي‌شود. اگر آنتي بادي HIV در سرم وجود داشته باشد، به اين آنتي‌ژن هاي HIV مي چسبد. سپس به منظور از بين بردن ديگر اجزا سرم، پليت شستشو داده مي شود. يك “آنتي بادي ثانويه” ساخته شده مخصوص (يك آنتي بادي چسبيده به آنتي بادي ديگري) به پليت اعمال شده و شستشوي ديگري انجام مي‌شود. اين آنتي بادي ثانويه به صورت شيميايي به آنزيم از پيش تهيه شده مي‌چسبد. اين‌بار زير لايه اي براي آنزيم اعمال شده و توسط آنزيم كاتاليز مي‌شود كه منجر به تغيير رنگ در فلورسانس مي شود.
با استفاده از روش ELISA چه چیزی تست می شود ؟
استفاده از روش ساندویچ انتخاب خوبی است برای یک پروتئین که با اپی توپ های متعدد شناسایی شده است،. این حالت معمولا نیاز به دو آنتی بادی دارد که با اپی توپ های مختلف واکنش نشان می دهند. با این حال، اگر مولکول دارای چندین اپی توپ تکراری باشد ممکن است با استفاده از روش ساندویچ از آنتی بادی یکسان برای هر دو جذب و تشخیص استفاده شود
روش دیگر، اگر یک منبع آنالیت دیگر برای شناسایی به شکل استخراج شده وجود داشته باشد که توانایی جذب در یک microwell را دارد، پس از آن با استفاده از روش های رقابتی می تواند روشی را راه اندازی نماید که که در آن آنالیت استخراج شده بی حرکت و آنالیت در نمونه برای اتصال به آنتی بادی برچسب دار شده رقابت ایجاد نماید
تست الايزا را در حالت معمول براي رديابي آنتي ژن يا آنتي بادي بكار مي برند بدين ترتيب كه يكي از اين دو ماده در بستر جامد ثابت مي شود و براي رديابي دومي بكار گرفته مي شود، اما اساسا براي رديابي هر جفت ماده اي كه مثل جفت آنتي ژن و آنتي بادي به هم گرايش داشته و قدرت اتصال مناسبي نسبت به هم دارند ميتواند بكار گرفته شود (مثلا لكتين به ليگاند مربوطه اش يا مولكول به گيرنده اختصاصي اش) البته اين پديده يعني اتصال بين دو ماده اي كه آنتي بادي و آنتي ژن نيستند اما گرايش به هم دارند اغلب اوقات مشكل آفرين است و براي بالا بردن حساسيت و اختصاصيت اتصال بين آنتي بادي و آنتي ژن در الايزا بايد اين اتصالات ناخواسته را به طريقي مهار كرده و يا كارهاي جبراني لازم را در نظر گرفت.
الايزا تركيبي از آنتي بادي هاي اختصاصي با حساسيت بالاست بوسيله آنتي بادي ها يا آنتي ژن ها جفت شده به راحتي تشخيص داده می شوند . الايزا مي تواند با سنجش مفيد، غلظت آنتي ژن يا آنتي بادي را انجام دهد 2 روش متفاوت وجود دارد
تست ELISA با روش‌هاي گوناگوني انجام مي‌شود كه كه به صورت كلي به دو دسته ELISA مستقيم و غير مستقيم تقسيم بندي مي‌شود.: الايزايي كه براي تشخيص حضور آنتي ژن ها مي تواند به كار رود كه بوسيله آنتي بادي شناسايي را انجام مي دهد يا آن مي تواند آزمايش كند آنتي بادي هايي كه آنتي ژن ها را شناسايي مي كنند در الايزاي عمومي 5 مرحله وجود دارد
1-ديواره پليت ها با آنتي ژن ها كد شده است
2-مسدود كردن تمام نواحي باند نشده براي جلوگيري از جواب هاي مثبت منفي
3-اضافه كردن آنتي بادي اوليه (براي مثال آنتي بادي مونوكلونال خرگوشي ) به چاهك ها
4-اضافه كردن آنتي بادي ثانويه جفت شده با آنزيم (مثل anti IgG موشي ) به چاهك ها
5-واكنش سوبسترا با آنزيم و توليد رنگ بنابراين مشخص شدن واكنش هاي مثبت
مراحل انجام يك آزمون ELISA كه تقريبا در تمام انواع آن مشترك است عبارت است از:
1) پوشش دهي، كه به معني جذب يك آنتي‌ژن يا آنتي‌بادي با سطوح جامد است.
2) اضافه كردن نمونه‌هاي مورد آزمايش.
3) گذشت مدت زمان كافي براي انجام واكنش كه به اصطلاح انكوباسيون واكنشگرها ناميده مي شود.
4) انجام عمل شستشو توسط واشر ELISA ، به منظورجدا كردن واكنشگرهاي متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهاي آزاد و متصل نشده ‌.
5) اضافه عوامل لينك شده با آنزيم.
6) مجددا طي مدت زمان انكوباسيون براي واكنشگرها ‌.
7)استفاده مجدد از واشر ELISA جهت انجام عمل شستشو ‌.
8) افزودن زيرلايه آنزيم جهت تشخيص واكنش دهنده‌ها.
9) طي زمان انكوباسيون.
10) اتمام واكنش آنزيمي توسط متوقف كننده‌ها و خوانش دانسيته نوري به دست آمده توسط خواننده
مراحل ELISA
1-فاز جامد میکرو پلیت هایی هستند که به طور تجاری در دسترس می باشند 8*12 خانه دارند

2- مرحله جذب سطحی : در این پروسه آنتی بادی یا آنتی ژن که بصورت محلول در یک بافر قرار دارد اضافه می شود سپس به طور تهاجمی به فاز جامد در حالت انکوبه حمله می کند در واقع عدم حرکت آنتی بادی یا آنتی ژن در فاز ثابت عامل اصلی موفقیت واکنش در ELISA است
3- مرحله شستشو : چاهک ها پر از محلول های بافری می شوند و خالی می شوند برای جدا شدن اتصالات و غیر اتصالات یا آنتی بادی ها یا آنتی ژن های آزاد در پلیت های الایزا ، این مرحله نقش مهمی را در واکنش ها بازی می کند
4- آنتی ژن ها : یک پروتئین یا کربوهیدرات است که وقتی به حیوانات تزریق می شود تولید آنتی بادی می کند بنابراین آنتی بادی ها به طور اختصاصی با آنتی ژن ها واکنش می دهند و می توان از آنها برای تشخیص آنتی ژن ها استفاده نمود
5- آنتی بادی : تولیداتی که در پاسخ به آنتی ژن ها ایجاد می شوند از جنس پروتیئن هستند
6- آنزیم : ماده ای که می تواند با یک غلظت پایین واکنش دهد مثل کاتالیز کردن واکنش های اختصاصی .چندین آنزیم اختصاصی به طور روتین در الایزا بکار می روند
7-آنزیم های کانجوگیت : آنزیم هایی که به طور تغییر ناپذیری به واکنش های مخصوصی حمله می کنند این واکنش ها سیگنالهایی مثل تغییر رنگ که قابل خوانش است ایجاد می کنند ( به طور مستقیم مثل تغییر رنگ ماده یا غیر مستقیم بوسیله تاثیر روی یک ماده شیمیایی دیگر )
8- توقف : پروسه توقف فعالیت آنزیم روی یک ماده .این مرحله تاثیر روی توقف تغییرات رنگی بعدی در ELISA دارد
9- خوانش: اندازه گیری رنگ تولید شده در ELISA . این کمیت بوسیله خوانش اختصاصی در اسپکتوفتومتری در ولتاژ مخصوص برای رنگ های خاص بدست آمده با آنزیم های خاص انجام می شود این تست ها می تواند بوسیله چشم تشخیص داده شود
چه نوع از روش های ELISA ممکن است به کار رود ؟
الایزای مستقیم: در این الایزا آنتی ژن ها به فاز جامد متصل شده اند و آنزیم ها به آنتی بادی لیبل شده اند این نوع از روش ها به طور کلی در اندازه گیری نمونه های سخت دشوار است، از آنجا که پروتئین های آلوده برای نواحی های اتصال پلاستیکی با هم رقابت دارند
الایزای غیر مستقیم : در این الایزا آنتی ژن ها به فاز جامد متصل شده اند اما در این مورد آنتی بادی اولیه لیبل ندارد وآنزیم کونجوگیتو بعنوان آنتی بادی ثانویه به طور مستقیم به آنتی بادی اولیه وصل می شوند این شکل اغلب به کار می رود
اين روش برای تعيين آنتی بادی اختصاصی و يا تيتراسيون آنتی بادی در نمونه های سرم مورد استفاده قرار می گيرد . اساس آزمايش بدين نحو است که معمولاً سرم رقيق شده به آنتی ژن های کوت شده در فاز جامد ( ميکروول يا چاهک ) اضافه می شود . آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه رد يابی شود ، پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسيون و يک مرحله شستشو آنتی هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهک اضافه می شود بر حسب اينکه چه کلاسی از آنتی بادی برای رديابی اهميت دارد نوع آنتی هيومن مورد استفاده نيز متفاوت است مثلاً برای رديابی آنتی بادی کلاس IgG از آنتی هيومن IgG و برای رديابی کلاس IgA از آنتی هيومن IgA استفاده می شود . بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتی بادی بر عليه توکسوپلاسما ، روبلا ، ويروس سيتومگال و هليکوباکتر پيلوری از کلاس IgM ، IgA و IgG در سرم می باشد .
الایزای رقابتی : این سومین نوع الایزا از روش رقابتی استفاده می کند در این روش به طور همزمان آنتی بادی ها یا پروتئین ها رقابتی اضافه می شود . کاهش در سیگنال نمونه ها جایی که آنتی بادی یا پروتئین دوم نتایج اختصاصی بالایی می دهد روش هاي رقابتي نيز بر پايه رقابت دو آنتي ژن يا دو آنتي بادي براي اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است. اگر اضافه كردن هردو آناليت به سيستم همزمان انجام شود، روش را رقابتي مي نامند ولي چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يك دوره زماني انكوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاري مي نامند.

ساندویچ الایزا : آخرین نوع روشی است که به کار می رود اتصال آنتی بادی ها به فاز جامد حمایت می شود نمونه ها حاوی آنتی ژن های شناخته شده یا ناشناخته هستند سپس بافر یا ماتریکسی اضافه می شود که اتصالات را به فاز جامد به حداقل رسانده اند آنزیم های لیبل شده به آنتی بادی ها سپس برای تشخیص اضافه می شوند . روش ساندويچ كه متداول‌ترين روش ELISA است، يك آنتي ژن در بين دو آنتي بادي اختصاصي قرار مي گيرد.
1-كد كردن پليت هاي الايزا با آنتي بادي و انكوبه كردن يك شب در 4 Ċ
2- شستشوي چاهك پليت با آب دوبار تقطير و PBS و تريتون براي 2 بار
3- مسدود كردن باند هاي غير اختصاصي با استفاده از 1% BSA/PBS و انكوبه براي 30-60 دقيقه در دماي اتاق
4-شتشوي پليت ،‌اضافه كردن استانداردها و 100ul نمونه محلول متناسب با چاهك ها
5-انكوبه 1 ساعت در دماي اتاق و شستشو
6-اضافه كردن 100ul آنتي بادي ثانويه جفت شده با آلكالين فسفاتاز (AP ) يا HPR و انكوبه براي 1 ساعت و شستشو
7-اضافه كردن 100ul سوبسترا به چاهك و انكوبه در دماي اتاق براي 1 ساعت ( افزودن محلول متوقف كننده )
8 – خوانش پليت ها روي الايزا ميكروپليت ريدر
بهترین نتیجه از روش ساندویچ بدست می آید روش ساندويچ الايزا خود به دو دسته تقسيم می شود :
الف ) روش Ag Capture يا Ab sandwich :
در اين روش يک آنتی ژن در بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد ، اين روش شايع ترين روش الايزا محسوب می شود ، در اين روش از يک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن بر روی چاهک های الايزا استفاده می شود و آنتی بادی دوم که با آنزيم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می کند .
قابل ذکر است که در اين روش آنتی ژن بايد دارای دو ناحِيه آنتی ژنيک متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر دو آنتی بادی باشد ، مثال های بارز اين روش اندازه گيری ،TSH ، LH ،FSH ، PSA ، HCG و …
ب ) روش Antibody Capture :

·Ag Sandwich or Direct Ab Capture :

اين روش برای تعيين سنجش آنتی بادی مورد استفاده قرار می گيرد بدين صورت که از يک آنتی ژن کوت شده بر روی فاز جامد به دام انداختن آنتی بادی اختصاصی آن استفاده می شود و همان آنتی بادی از طريق بازوی ديگر خود ( Fab ) پذيرای همان آنتی ژن اما به صورت نشاندار می باشد ، در نتيجه آنتی بادی اختصاصی در بين دو آنتی ژن ساندويچ می گردد . در اين روش تعيين آنتی بادی توتال از هر کلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يکی از اختصاصی ترين و حساس ترين روش ها برای تشخيص آنتی بادی در نمونه است . مثال بارز اين روش کيت اندازه گيری آنتی بادی بر عليه پلاسموديوم ويواکس و ترپونما پاليدومو HBsAb می باشد.
4 – الايزای رقابتی يا مهاری
رویداد مرکزی ELISA رقابتی یک فرایند اتصال رقابتی است که توسط آنتی ژن اصلی (آنتی ژن نمونه) و آنتی ژن افزودنی انجام می شود . روش ELISA رقابتی در برخی موارد در مقایسه با ELISA غیر مستقیم، ELISA ساندویچ و ELISA مستقیم متفاوت است.روش به شرح زیر است:
1-آنتی بادی اولیه فاقد لیبل با آنتی ژن نمونه انکوبه می شود
2-کمپلکس آنتی بادی و آنتی ژن به پلیت 96 خانه اضافه می شوند که از قبل با آنتی ژن مشابه کدگذاری شده است
3-آنتی بادی های غیر متصل شده بوسیله شستشو پلیت حذف می شوند
4-آنتی بادی ثانویه که اختصاصی برای آنتی بادی اولیه است و با یک آنزیم همراه است اضافه می شود
5-سوبسترا اضافه شده و آنزیم باعث ایجاد یک سیگنال رنگی یا فلورسنتی می شود
مزایا :

مزیت اصلی الایزای رقابتی شامل آنزیم های متصل شده به آنتی بادی است
اختصاصیت بالا ، از اینرو 2 آنتی بادی استفاده می شود
مناسب برای نمونه های کمپلکس ، از اینرو نیاز نیست آنتی ژن ها در ابتدا استخراج شوند و اندازه گیری شوند
انعطاف و حساسیت

در روش های رقابتی اساس سنجش بر رقابت دو آنتی ژن يا دو آنتی بادی ( که يکی از آن دو نشاندار است ) برای اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است اگر هردو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يک دوره انکوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری يا بلاکينگ می نامند . در روش مهاری ممکن است در بين دو مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدی شستشو انجام شود يا انجام نشود ، مثال بارز روش های رقابتی و مهاری سنجش T4 و T3 می باشد .انواع روش هاای رقابتی عبارتند از :
الف ) روش سنجش رقابتی يا مهاری برای آنتی ژن :
اساس اين روش بر رقابت بين آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی بادی اختصاصی کد شده در چاهک استوار است . در اين روش مقدار آنتی بادی کد شده بايد محدود باشد و ملکول سيگنال دهنده همان آنتی ژن نشاندار است ، اساس روش RIA و EIA کلاسيک همين روش است .
در اين روش منحنی پاسخ دوز به صورت معکوس خواهد بود ، بدين معنی که آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادی از آناليت غير نشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود و در نتيجه سيگنال کمتری هم وجود خواهد آمد .
در برخی از موارد نشاندار کردن روی خصوصيات هاپتن اثر می گذارد در نتيجه در روش رقابتی برای تعيين آنتی ژن از يک آنتی بادی نشاندار استفاده می شود ، در اين نوع از سنجش ها اين مطلب ضروری است که فاز جامد توسط آنتی ژن با مقدار کم و ثابت پوشيده می شود ، در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت کد شده در چاهک برای اتصال به آنتی بادی نشاندار رقابت می کند . در اينجا هم منحنی استاندارد معکوس است ، از اين روش بيشتر برای سنجش ايمنی به روش کمی لومينسانس استفاده می شود .
ب ) روش رقابتی برای آنتی بادی :
در اين روش رقابت بين دو آنتی بادی يکی در نمونه به صورت غير نشاندار و يکی به صورت نشاندار شده با آنزيم برای اتصال به يک آنتی ژن کد شده در چاهک صورت می پذيرد ، بديهی است که هر چه مقدار آنتی بادی نمونه بيشتر باشد آنتی بادی نشاندار کمتری به چاهک ها متصل شده و سيگنال نيز کمتر خواهد بود و در نتيجه منحنی استاندارد نيز معکوس می باشد ، شاخص ترين مثال برای اين روش اندازه گيری آنتی بادی بر ضد HBc ( HBc Ab ) است .